[发明专利]一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法

说明书

本发明公开了一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，该方法包括对肝素钠副产物进行溶解、沉淀，得到硫酸乙酰肝素粗品；然后对硫酸乙酰肝素粗品进行二次溶解、氧化、冷沉取上清液，再次沉淀，再溶解，吸附，洗脱，沉淀，最终获得超高纯度硫酸乙酰肝素。本发明方法克服了硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素钠难以分离的难题，提高了硫酸乙酰肝素的收率和纯度，并且本发明方法操作简单，产品质量稳定，适合规模化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地说，尤其涉及一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法。

背景技术

硫酸乙酰肝素是一种天然的糖胺聚糖，与肝素钠结构类似，但是硫酸乙酰肝素分子量较小，乙酰化程度高，硫酸基含量较少，抗凝活性缓和。硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者肾脏保护，是今年来研究最热的粘多糖类生化药物。硫酸乙酰肝素、肝素钠、硫酸皮肤素、硫酸软骨素这几种物质性质相似，采用传统的离子交换层析和有机溶剂分级沉淀方法难以将硫酸乙酰肝素纯化。

中国专利ZL 201510127522.2公开了一种精确定量控制肝素/类肝素中硫酸软骨素(CS) 及硫酸皮肤素(DS)含量的方法，该方法步骤如下：(1)向含类肝素/肝素的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质，待DS含量达到预期值时，终止酶解反应；(2)向溶液中继续加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质，待CS含量达到预期值时，终止酶解反应，即得到期望CS及DS含量的肝素样品或类肝素样品。而硫酸乙酰肝素是粗肝素经过乙醇沉淀、阴离子交换层析后得到的一种肝素衍生物。尽管上述发明中能够精确定量控制硫酸软骨素和硫酸皮肤素的含量，但是无法实现类肝素中硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的分离或者精确定量控制。

中国专利ZL 201610010556.8公开了一种从十二指肠中提取硫酸乙酰肝素的方法，该方法以生物酶与酸碱处理方法相结合，经过猪十二指肠→绞碎→酶解→加热→离心→树脂吸附→洗脱→沉淀→碱加热→酸处理→低倍沉淀→氧化→沉淀→真空干燥得到硫酸乙酰肝素。该专利方法实质上是去除十二指肠的油脂、酸性蛋白质、碱性蛋白质和核酸后得到硫酸乙酰肝素，但因为其它种类的糖胺聚糖(比如硫酸皮肤素)也会被树脂吸附，并在直接的氯化钠浓度下洗脱，从而导致糖胺聚糖与硫酸乙酰肝素混杂在一起。虽然后续步骤使用了调酸离心方法来去除硫酸皮肤素，但该方法会有硫酸皮肤素残留在上清液，因此硫酸乙酰肝素始终伴随有硫酸皮肤素，故得到的硫酸乙酰肝素纯度不高。

中国专利ZL 201510394022.5公开了一种从肝素副产物废蛋白中分离类肝素的方法，该方法将肝素副产物废蛋白溶解，加吸附剂，洗脱醇沉，氧化醇沉烘干，得到类肝素干品，但该类肝素干品不仅含有硫酸乙酰肝素、至少还含有抗凝活性较高的快肝素等粘多糖，说明类肝素干品中硫酸乙酰肝素纯度不高。

中国专利ZL 200910039359.9公开了一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，该方法以肝素副产物为原料，溶解后加入醋酸钾，通过醋酸调节溶液的pH值，去沉淀后得到硫酸多糖溶液，向硫酸多糖溶液加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，沉淀中再加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，清液合并，上一根阴离子交换性质的层析柱，以氯化钠溶液洗去铜离子，再以氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液蒸发浓缩以乙醇沉淀得到高纯度的硫酸乙酰肝素。该发明使用了含铜的斑氏试剂，工艺不环保，且后续还需要除铜，流程复杂，且除铜效果如何不得而知。

中国专利ZL 201210424451.9公开了一种从肝素副产物中分离提纯肝素钠和硫酸乙酰肝素的方法，该方法包括将原料肝素副产物溶解后加入醋酸钾使肝素钠沉淀分离，沉淀溶解后再加入醋酸钾沉淀，收集沉淀，溶解后经过无水乙醇多次分级沉淀，进而制得纯度较高的肝素钠；上清液通过加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，离心得到含有硫酸乙酰肝素的溶液，以除铜剂除去铜离子，加入活性炭吸附沉淀并脱色后过滤，再通过阴离子交换树脂吸附和洗脱，分离得到高纯度的硫酸乙酰肝素。该发明使用了含铜的斑氏试剂，工艺不环保，且后续还需要除铜，流程复杂。