[发明专利]一种基于单肿瘤样本高通量测序微卫星不稳定性探测位点筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于单肿瘤样本高通量测序微卫星不稳定性探测位点筛选方法，该方法基于优化后的微卫星位点状态标志，采用机器学习技术，通过对每个微卫星位点进行建模分析，利用有效位点被判别为微卫星不稳定位点的百分比来探测每个样本是否为微卫星不稳定状态，实现只利用肿瘤样本测序数据来探测微卫星不稳定状态，能够高精度判断多个微卫星位点的稳定性，实现准确稳定的微卫星不稳定状态基因检测。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种基于单肿瘤样本高通量测序数据的微卫星不稳定性探测位点筛选方法。

背景技术

近年来，人类基因组测序技术在疾病，健康，衰老等方面的应用越来越广泛，随着测序技术的成熟，特别是下一代测序技术已经逐渐应用于临床诊断。下一代测序技术的发明使得测序技术实现自动化高通量两个特点，使得测序价格越来越低。除了下一代测序技术，目前单细胞测序也为人类在微观层面上观测人类基因组序列信息提供了更多的便利。

目前，肿瘤已经成为中国主要死亡原因且肿瘤负担仍在持续上升，发病率也在逐年增大，为了减少死亡率，减轻患者的痛苦，精准医疗与个体医疗显得十分重要，通过单肿瘤样本高通量测序数据的微卫星不稳定性探测个体化用药也随之成为当前的发展趋势。微卫星不稳定性（Micro-Satellite Instability , MSI）是指脱氧核糖核苷酸（DNA）复制过程中由于重复序列非正常插入或移除导致微卫星等位基因长度发生变化，且该变化因为DNA错配修复机制的基因发生启动子甲基化抑制基因表达或发生失活、截短突变）无法通过DNA错配修复系统（Mismatch Repair System, MMR）进行修正等种种原因。当细胞中与DNA错配修复系统相关的基因发生突变或者异常表观修饰而失活时，就会产生微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）的表型。大量研究表明，微卫星不稳定性与肿瘤的发生有关，并在肿瘤的治疗和预后的过程中具有重要的作用。因此，选择合适的基于单肿瘤样本高通量测序数据的微卫星不稳定性探测位点筛选方法具有非常重要的意义。

目前临床中微卫星不稳定性（MSI）检测方法主要依赖于美国肿瘤研究所制定的检测标准，即检测两个单核苷酸重复位点（BAT-25，BAT-26）和三个二核苷酸重复位点（D2S123，D5S346，D17S250）共五个基因组微卫星位点的稳定性。这种方法通过PCR扩增然后通过电泳实验对比肿瘤样本和正常对照样本在目标重复区域的拷贝数情况来决定微卫星位点的稳定性。根据检测样本中不稳定性位点占总检测位点数的比例可以将样本微卫星不稳定性状态确定为高不稳定（MSI-H），低不稳定（MSI-L）和稳定（MSS）三种状态。这种检测方法检测位点过少，实验方案复杂，耗费时间较长，且只能检测限定的标志物。

随着二代测序（NGS）在肿瘤生物学的深入拓展，一些计算机算法已经开发用NGS数据来确定MSI的状态。计算机算法，例如微卫星不稳定性分析软件MSIsensor, MANTIS和mSINGS是通过检查来自正常和肿瘤配对样本的测序数据计算不稳定的微卫星位点的占比。微卫星不稳定性分析软件MSIseq，MOSAIC和MIRMMR使用了基于微卫星突变位点，甲基化和其他微卫星特点的机器学习分类器。MOSAIC和MSIseq通过处理更小但是微卫星特点更集中的文件（样本重复区域中观察到的每兆区域的微插入微缺失）来对MSI数值进行评估。MSIsensor是一款在肿瘤/正常组织（Tumor-normal）基因组测序数据中定量MSI的软件，它识别人类基因组中对应微卫星位点的体细胞突变状态。MSIsensor的性能已经得到纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）在15000例实体瘤中的验证，已投入日常的医疗检测。

尽管MSI检测如今越来越成为许多医疗机构中的常规项，但是在实际的临床操作中，配对的正常样本并不在样本采集的日常要求；同时，相匹配的非肿瘤组织可能很难在临床操作中获取。肿瘤/正常组织配对（Tumor-normal paired）分析，即使是正常组织采用低深度测序，依然会造成成本的显著上升。不仅如此，如果配对的正常样本来自血液或是唾液，肿瘤/正常组织分析无法捕捉到样本保存和核酸提取的系统噪音。