[发明专利]飞行质谱基因分型检测方法

说明书

本发明公开了飞行质谱基因分型检测方法，该方法包括以下几个步骤：(1)针对SNP位点，设计3条寡核苷酸探针，第一条和第二条探针的3/端分别是预先选定SNP位点的两个等位基因型，即等位基因特异性寡核苷酸探针(allele‑specific oligos，ASO)；(2)当与目标序列完全匹配时；(4)使用限制性内切酶将PCR产物进行酶切，并使用链霉亲和素包被的beads进行纯化；(5)将纯化产物移至384孔芯片上。采用MALDI‑TOF质谱法进行SNP位点分型，操作简单、成本低、分辩率高的方法给出SNP分型。

技术领域

本发明涉及使用飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption-ionization–time-offlight(MALDI–TOF)mass spectrometry(MS))分析生物核酸分子中单核苷酸多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphisms)，特别涉及飞行质谱基因分型检测方法。

背景技术

SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入等变化，且在群体中的发生频率不小于1％。它与许多疾病的易感性和药物反应差异有关。SNP具有数量多、分布广、遗传稳定等特点，在人类基因组中大概每1000个碱基平均就有一个SNP，人类基因组上的SNP总数大概是300万个。同时在基因组的编码区和非编码区都存在SNP，可以全面地反映遗传及变异情况，也可以挑选感兴趣基因的位点来解释不同群体或个体对疾病、药物和环境的差异，从而为遗传性疾病的研究提供基础。另外，很多物种SNP是两种等位基因，即只有两种碱基组成，只需要通过某种方法检测出这两种碱基即可完成基因分型。随着SNP发现数目的增加，需要找到一种准确、高通量、低成本的方法对SNP分型并评估对遗传变异的生物学影响，传统Sanger DNA测序被认为是SNP分型的金标准，但是该方法依赖于gel琼脂糖电泳，会产生大量的信息，并且耗时，繁琐。随后一些非gel依赖的分型方法也被逐渐完善，包括allele特异的杂交，allele特异的引物延伸，allele特异的寡核苷酸连接，allele特异的探针切割等，并通过荧光信号强度、质谱等检测方法进行SNP分型。

基于引物延伸原理的质谱法得到了广泛的应用，尤其是MALDI–TOF质谱在SNP分型检测市场上得到了广泛的应用，其基本原理是：先设计特异性引物，经多重PCR扩增含有待测SNP位点的DNA片段，然后针对待测SNP位点设计延伸引物，并在反应体系中加入ddNTP和DNA聚合酶，使得PCR退火时，引物3/端的碱基刚好与待测SNP位点的碱基互补结合，即引物延伸到多态性位点，链延伸终止。通过MALDI–TOF MS检测引物及延伸产物两个峰，两者的m/Z差值，即为该引物延伸碱基的分子量，从而判断SNP位点的碱基类型。目前较成熟的方法包括：MassExtend assay，iPLEX assay，PinPoint assay，GOOD assay等，他们有一个共同点，都是通过精确测量延伸产物的分子量，从而判断样品中SNP位点的碱基。

但基于引物延伸的质谱检测方法，在其应用过程中也存在一定的缺陷。

采用了两步PCR，首先通过PCR将感兴趣的区段进行扩增富集SNP位点的拷贝数，然后再进行单碱基延伸反应，为了避免PCR反应剩余的dNTPs和引物影响单碱基延伸的效率，在PCR反应结束后使用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)将PCR产物中的剩余引物和dNTP降解掉，这种方法的缺点是对样品要求高，纯化结果不好，会影响到后续的单碱基延伸反应。

质谱仪的检测效果与延伸物的分子量紧密相关，分子量越小，区分效果越好。而Sequenom iPLEX assay没有对含SNP位点的寡核苷酸片段进行限制性酶切或用磷酸二酯酶切割(GOOD assay)，片段较大，使得检测范围偏大(4000-9000Da)，从而影响了MALDI–TOF分辨率。在延伸引物和产物在高分子量范围，信号强度也会降低，或许是解吸附效率不高或者检测元件对于高分子量的分子检测敏感度下降。