[发明专利]一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法

说明书

本发明提供了一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法。所述分离方法包括如下步骤：用羧肽酶对奥马珠单抗样品进行酶切；用离子交换高效液相色谱对奥马珠单抗样品，或者羧肽酶酶切后的奥马珠单抗样品进行分离。本发明提供的分离方法检测时间适宜，40min即可完成检测，酸峰、主峰和碱峰的出峰时间适宜，各峰的分离度高，该分离方法具有较高的专属性、准确度及精密度，稳定可行。

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法。

背景技术

奥马珠单抗(Xolair)是选择性结合人类免疫球蛋白E(IgE)的一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，具有约149kD的分子量。奥马珠单抗目前适用于治疗皮肤测试呈阳性或在体外对长期气源性致敏原具有反应性且具有吸入性皮质类固醇不充分控制的症状的患者中的中度至重度持久性哮喘。是全球首个批准治疗中至重度哮喘的靶向治疗药物，该产品于2003年首次在全球上市，已在96个国家获得批准，包括美国、欧盟、日本等。

用奥马珠单抗的问题在于：1)其在药学相关剂量下靶向游离IgE，但不靶向(或不能有效靶向)IgE/FcεRI复合物的致病性种类；2)可能由于IgE/FcεRI复合物的的致病性种类不被靶向；3)其不应当用于具有高IgE水平的患者(例如，因为IgE/FcεRI复合物的致病性种类不被靶向，且鉴于患者中的高游离IgE水平而不会随时间耗散)；4)“当服用奥马珠单抗时可以发生I型局部或全身反应，包括过敏反应和过敏性休克”；5)其对IgE的亲和力并不是特别好。

奥马珠单抗作为复杂的大分子物质，在细胞培养、纯化、运输、存储过程中，可能在组成氨基酸、二硫键、糖基化等层面发生不同程度的变化，进而引起电荷变化。电荷异质体的修饰微店、种类可能影响奥马珠单抗的功能和稳定性，因此对奥马珠单抗的电荷异质体的分析具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法。该分离方法稳定可行，具有较高的专属性和准确度。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：

(1)用羧肽酶对奥马珠单抗样品进行酶切；

(2)用离子交换高效液相色谱对奥马珠单抗样品，或者羧肽酶酶切后的奥马珠单抗样品进行分离。

本发明利用离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)柱对不同离子的分离能力，即带电荷的单抗与固定相之间发生离子交换能力的差异，从而分离单抗的电荷异质体。通过对得到的色谱图中各峰进行积分分析，可以得出电荷异质体的含量；通过分析羧肽酶(CPB酶)酶切前后奥马珠单抗样品的色谱图的变化，可以得知奥马珠单抗样品中电荷异质体的种类。

作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述羧肽酶与所述奥马珠单抗样品的质量比为(1-5):100，例如可以是1:100、1.5:100、2:100、2.5:100、3:100、3.5:100、4:100、4.5:100或5:100等；进一步优选为1:100。

作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述酶切的反应温度为35-40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等；进一步优选为37℃。

优选地，步骤(1)中所述酶解的反应时间为3-6.5h，例如可以是3h、3.2h、3.5h、3.8h、4h、4.2h、4.5h、4.8h、5h、5.2h、5.5h、5.8h、6h、6.2h或6.5h等；进一步优选为3h。