[发明专利]一种丙二酸的全生物合成的方法

说明书

本发明公开了一种丙二酸的全生物合成的方法，属于生物工程技术领域。本发明是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，模块过量表达来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)，琥珀酸脱氢酶基因(sdhC)，琥珀酸半醛脱氢酶基因(yne1)，天门冬氨酸酶基因(aspa)，来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸‑α‑脱氢酶基因(panD)，来自铜绿假单胞菌的异源基因β‑丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0123)，构建了丙二酸的全生物合成途径，使工程菌成功积累丙二酸。本发明丙二酸及其前体物的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。

技术领域

本发明涉及一种丙二酸的全生物合成的方法，属于生物工程领域。

背景技术

丙二酸(malonic acid，malonate；Propanedioic acid；Propane diacid)又称胡萝卜酸、缩苹果酸或甜菜酸。分子结构中具有活性亚甲基和羧基两种官能团，因而可以参加各种化学反应，是非常重要的有机合成中间体。其主要应用于香料、粘合剂、树脂添加剂、医药中间体、电镀抛光剂、爆炸控制剂、热焊接助熔添加剂等方面。

目前工业上常用水解氰乙酸和丙二酸酯水解的方法制丙二酸。但水解氰乙酸法使用了NaCN，而氰离子有剧毒，对环境危害大，且反应过程复杂。丙二酸酯水解主要是使用丙二酸二甲(乙)酯直接进行水解来制备丙二酸，其中丙二酸酯也是通过氯乙酸进行中和，氰化等反应制备出氰乙酸，之后再酯化生产丙二酸酯，同样对环境危害大，反应过程复杂。并且通过这两种方法得到丙二酸需要经过复杂繁琐的提纯工序，对工业化生产有所限制。

为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成丙二酸的道路上。但由于缺乏合适的酶和代谢途径的知识，丙二酸的生物生产研究进展缓慢。丙二酸半醛是丙二酸的重要前体，但是由于丙二酸半醛脱氢酶的缺失，使得这步转化比较困难，也因此使得丙二酸生物生产进展缓慢。

发明内容

针对上述问题，本发明首先提供了一种产丙二酸的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)，琥珀酸脱氢酶基因(sdhC)，琥珀酸半醛脱氢酶基因(yne1)，天门冬氨酸酶基因(aspA)，来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸-α-脱氢酶基因(panD)，来自铜绿假单胞菌的异源基因β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0123)。

在本发明的一种实施方式中，所述分模块过量表达是将基因yne1、pa0123融合表达，将基因aspa、panD融合表达，将基因sdhC、ppc融合表达。

在一种实施方式中，所述ppc的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sdhC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述aspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述panD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pa0123的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述yne1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，基因yne1、pa0123以pRSFDuet-1为表达载体；基因aspa、panD以pTrc99a为表达载体；基因片段sdhC、ppc以pCDFDuet-1为表达载体。

本发明还提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段yne1、pa0123，得到重组质粒pRSF-yne1-pa0123；

(2)以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段aspa、panD，得到重组质粒pTrc99a-aspa-panD；

(3)以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段sdhC、ppc，得到重组质粒pCDF-sdhC-ppc；