[发明专利]一种冻存大体积脂肪组织的方法

说明书

本发明公开了一种冻存大体积脂肪组织的方法，包括以下步骤：（1）自体血浆的制备；（2）脂肪组织的前处理；（3）脂肪组织的冻存。本发明通过使用配制的脂肪组织冻存液，再辅以自体血浆，以保持冻存的脂肪组织的活性，且冻存后的细胞复苏率高，本发明提供的冻存大体积脂肪组织的方法，既不影响脂肪组织的生物活性，又能最大限度保护脂肪组织中的细胞不受损伤；同时能够一次性储存大量体积的脂肪组织，冻存脂肪组织在复苏后生长状态良好，真正做到“一次吸脂，多次使用”。

技术领域

本发明涉及生物组织细胞保存领域，具体涉及一种冻存大体积脂肪组织的方法。

背景技术

脂肪组织（adipose tissue）是以脂肪细胞为主体的细胞团块．由疏松结缔组织分隔成小叶结构的一种特殊结缔组织。其中，自体脂肪作为一种理想的填充材料，由于其具有来源丰富、取材容易、组织相容性好、无排斥反应、恢复快、不留瘢痕等优点，因此被广泛应用于整形外科领域。但是，自体脂肪移植存在过度吸收问题，临床上常需要进行少量、多次移植才能达到预期的治疗效果；而多次手术操作势必会增加患者的手术风险、身心痛苦、治疗费用以及手术医生的工作量。如果能实现“一次吸脂、多次使用”，则在临床工作中具有重要的应用价值。这就需要对抽取的多余脂肪进行适当的保存。

低温冷冻保存被公认为是组织与器官长期保存的最有效方法之一，其主要是通过低温条件抑制细胞内新陈代谢过程中的化学反应，从而使细胞得以长期保存。虽然低温冷冻能使生物组织长期保存，但也带来了冷冻损伤的问题。因此，需要配以合适的冷冻保护剂进行冷冻保存。

冷冻保护剂是指一类可以保护细胞抵抗低温或超低温对细胞产生的损害的化合物，是保证生物材料免受冷冻和解冻损伤的重要因素。常用的冷冻保护剂可分为两类，一类是渗透性冷冻保护剂，容易透过细胞膜，如丙三醇、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇等；另一类是非渗透性冷冻保护剂，包括蔗糖、葡聚糖和聚乙烯乙二醇（PEG）等。

目前，关于低温冷冻保存脂肪组织的研究较少，主要是关于小体积的脂肪组织冻存方法的研究，尚未有专门的冻存大体积脂肪组织的方法。

发明内容

本发明提供一种冻存大体积脂肪组织的方法，通过使用配制的脂肪组织冻存液，再辅以自体血浆，以保持冻存的脂肪组织的活性，且冻存后的细胞复苏率高。

本发明解决其技术问题采用以下技术方案：

一种冻存大体积脂肪组织的方法，所述冻存大体积脂肪组织的方法包括以下步骤：

（1）自体血浆的制备：用EDTA抗凝采血管采集供者外周血，用体积浓度为70~80%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，将外周血转移分装至40~60mL离心管中，1800~2200rpm转速下离心8~12min，离心结束吸取上层血浆至另一离心管中，然后置于50~60℃水浴中灭活，灭活结束后在2500~3500rpm转速离心8~12min，去除沉淀，得到自体血浆并置于0~6℃保存；

（2）脂肪组织的前处理：采用吸脂术在供者手术部分抽吸脂肪组织于注射器内，保持0~10℃转移至实验室，用体积浓度为70~80%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，静置2~4min，排尽液体；将脂肪组织分装至洁净的200~250mL离心管内，每管体积为80~100mL，加入等体积缓冲液进行洗涤，离心，去除上层液态油脂和下层含有血凝块和条索纤维的缓冲液，重新加入等体积缓冲液反复洗涤2~4次，直至缓冲液澄清，去除洗涤液；

（3）脂肪组织的冻存：将脂肪组织转移至离心管内，每管体积为80~100mL，加入制备好的自体血浆，混匀，然后再加入等体积0~8℃预冷的脂肪组织冻存液，混匀后在0~8℃平衡8~12min，然后转入-25~-15℃冻存25~35min，最后采用无菌棉垫包裹并转移至-90~-70℃冰箱保存。

作为一种优选方案，所述步骤（1）中灭活时间为25~35min。