[发明专利]一种抗草甘膦植物EPSPS酶双突变体及其克隆、表达与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过基因突变技术对来源于甘蓝型油菜的EPSPS酶进行定向进化，以对其草甘膦抗性进行改良，并公开该突变体及其编码基因在新型耐草甘膦作物培育领域中的应用。本发明所述抗草甘膦植物EPSPS酶双突变体，通过体外定向进化技术改造甘蓝型油菜EPSPS基因BnEPSPS，使之对草甘膦抗性的提高，进而获得具有草甘膦抗性的植物来源的EPSPS双突变体BnEV1和BnEV2。突变体BnEV1和BnEV2酶学性质测定表明草甘膦耐受性显著提升，并验证其应用到植物中提高植物的抗性，可为培育消费者更易接受的转基因抗草甘膦油菜新品种，提供重要的遗传资源，具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过基因突变技术对来源于甘蓝型油菜的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)进行定向进化，以对其草甘膦抗性进行改良，并进一步公开了该突变体及其编码基因在新型耐草甘膦作物培育领域中的应用。

背景技术

在作物种植时，由于杂草与农作物争夺有限的光照、水分和营养等物质，会严重影响农作物的产量，而日益攀升的人工除草的成本也使得农作物收益减少。草甘膦(商品名为Roundup)化学名N-磷酸亚甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)glycine，GLP)，草甘膦与甘氨酸结构类似，属于甘氨酸的衍生物。草甘膦是一种非选择性、高效除草剂，具有高效、广谱和易降解的特点，是目前全球生产和使用最为广泛的广谱除草剂，也是目前全球使用量最大的农药。研究显示，草甘膦与抗草甘膦作物的联合使用可以有效解决除草难的问题，而如何有效提高作物的抗草甘膦性能也具有重要的作用。

在生物体内，由于芳香族氨基酸会参与维生素、生物碱和吲哚衍生物等多种物质的合成，并在蛋白质合成、细胞分裂等过程中发挥重要的生物功能。因此，生物体内芳香族氨基酸的减少会严重干扰植物的正常代谢，并进而影响植物的生长发育。研究表明，莽草酸途径是连接碳水化合物和芳香族氨基酸生物合成的重要生物代谢途径，对于植物芳香族氨基酸的生物合成具有极其重要的地位，该途径只存在于细菌、真菌、藻类和植物中。莽草酸途径的关键酶即是5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，该酶是莽草酸途径中第六步的关键酶，以PEP和3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate，S3P)为底物，催化合成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)；随后分支酸合成酶催化EPSP形成芳香族氨基酸的前体物分支酸。草甘膦与EPSPS的作用底物之一PEP的过渡态具有类似的结构，因此具有竞争性地抑制EPSPS的作用。草甘膦的作用机理是以竞争磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和非竞争莽草酸-3-磷酸(S3P)的方式同植物体内5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)结合，形成稳定的EPSPS-S3P-草甘膦复合物，引起EPSPS活性的丧失，大量碳源流向S3P造成莽草酸在组织中快速积累。另一方面，蛋白质生物合成所必需的芳香族氨基酸合成则严重受阻，最终导致植物生长受到抑制直至死亡。草甘膦在发挥其除草功效的同时，随之带来的确是不得不面对的安全隐患，其中最重要的即是如何解决种植作物的抗草甘膦性能。

目前，国际上广泛应用的抗草甘膦基因为CP4-EPSPS，其来源为草甘膦极度污染的环境中分离得到的农杆菌CP4-Agrobacterium tumefaciens-^[]。相对于跨物种的基因转移，利用作物自身的基因进行抗除草剂育种，理论上更容易消除消费者对转基因安全的顾虑。

甘蓝型油菜(Brassica napus)，十字花科芸苔属植物，是世界四大油料作物之一，具有重要的经济价值。目前，转基因抗草甘膦油菜在加拿大，美国及澳大利亚广发种植，取得了巨大的经济效益。目前所用的抗性基因均为Agrobacterium tumefaciens CP4来源的EPSPS，但甘蓝型油菜EPSPS对草甘膦敏感，抗草甘膦性能并不突出。因此，如何进一步提高甘蓝型油菜等作物的抗草甘膦性能具有重要的意义。

发明内容