[发明专利]一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法

说明书

本发明提供了一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法。所述测试方法包括如下步骤：在液相环境中用蛋白变性液和二硫键还原剂对雷莫芦单抗样品进行变性还原处理；加入烷基化试剂，进行烷基化反应，用二巯基苏糖醇终止反应；进行脱盐，然后加入胰蛋白酶进行酶解，用有机酸终止酶解反应并酸化肽段；用超高效液相色谱进行检测，得到所述雷莫芦单抗的肽图。本发明提供的测试方法简单易行，90min即可完成测试，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好，稳定可行。

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法。

背景技术

雷莫芦单抗是一种完全人源化IgG1单克隆抗体，分子式为C₆₃₇₆H₉₈₈₆N₁₇₀₂O₁₉₉₆S₄₆，分子量约147kDa，它是由两条重链和两条轻链组成的多肽。两条重链分别由446个氨基酸组成，两条轻链分别由214个氨基酸组成。

雷莫芦单抗能特异性的与血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)结合，阻断VEGFR-2与其配体VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D的结合。雷莫芦单抗与VEGFR-2的结合力大约是VEGFR-2与其配体VEGF-A结合力的8倍，因此能抑制VEGF刺激内皮细胞的增殖和迁移，最终抑制肿瘤血管的生成。雷莫芦单抗目前被获批适用于晚期胃癌、食管胃交界腺癌、结肠癌及非小细胞肺癌的二线治疗。

肽谱图分析(Peptide Mapping)是根据蛋白质分子量大小以及一级结构氨基酸组成特点，使用专一性较强的胞内蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将蛋白裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成的特征性指纹图谱。

通过肽图可以对蛋白质或多肽类药物的多肽结构进行研究，而多肽结构又与药物的生物医药特性和功效息息相关。因此开发适宜的方法，对雷莫芦单抗的肽图进行测试具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法。该测试方法简单易行，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好，稳定可行。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法，所述测试方法包括如下步骤：

(1)在液相环境中用蛋白变性液和二硫键还原剂对雷莫芦单抗样品进行变性还原处理；

(2)在步骤(1)得到的溶液中加入烷基化试剂，进行烷基化反应，用二巯基苏糖醇终止反应；

(3)对步骤(2)得到的溶液进行脱盐，然后加入胰蛋白酶进行酶解，用有机酸终止酶解反应并酸化肽段；

(4)用超高效液相色谱对步骤(3)处理后的样品进行检测，得到所述雷莫芦单抗的肽图。

本发明采用胰蛋白酶对雷莫芦单抗进行酶解处理，结合超高效液相色谱实现了对雷莫芦单抗肽图的测试。该测试方法简单易行，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好。

作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述蛋白变性液中含有盐酸胍；

优选地，步骤(1)所述液相环境中盐酸胍的浓度为5.5-6.5M，例如可以是5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M、6M、6.1M、6.2M、6.3M、6.4M或6.5M等；进一步优选为6M。

如无特殊说明，则本发明中单位“M”为mol/L，单位“mM”为mmol/L。

优选地，步骤(1)中所述二硫键还原剂为二巯基苏糖醇。