[发明专利]一种提取游离核酸的试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种提取游离核酸的试剂盒，其特征在于，包括蛋白酶K、裂解缓冲液Buffer CL、吸附结合液Buffer CB、异丙醇、第一次清洗液Buffer GW1、第二次清洗液Buffer GW2和洗脱缓冲液Buffer EBL；所述裂解缓冲液Buffer CL中的成分含量为：100mM Tris-HCl，6M异硫氰酸胍溶液，10％(w/v)SDS缓冲液、0.3M氯化钠，20mM EDTA缓冲液，1％二甲基亚砜和水，所述裂解缓冲液Buffer CL的pH值为7.0；所述吸附结合液Buffer CB中的成分含量为：3.5％(w/v)柠檬酸钠缓冲液，5M异硫氰酸胍溶液，1M氯化钠，1％TritonX-100和20mM HEPS-KOH，3M硫脲，20％PEG(v/v)，所述吸附结合液Buffer CB的pH值为7.0，在使用所述吸附结合液Buffer CB之前加入20％(w/v)的异丙醇；所述第一次清洗液Buffer GW1中的成分含量为：100mM Tris-HCl、6M盐酸胍、1M氯化钠、10mM EDTA缓冲液和60％无水乙醇，所述第一次清洗液Buffer GW1的pH值为8.0；所述第二次清洗液Buffer GW2中的成分含量为： 100mM Tris-HCl、80％乙醇，所述第二次清洗液Buffer GW2的pH值为8.0；所述洗脱缓冲液Buffer EBL中的成分含量为：5mM Tris-HCl和水，所述洗脱缓冲液Buffer EBL的pH值为8.0。

2.根据权利要求1所述的提取游离核酸的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.取1-10ml体液样本，于3000-5000xg离心5-10min后取上清置干净的离心管中，于10000-16000rpm高速离心5-10min后收集上清液；

S2.向收集的上清液中加入蛋白酶K和裂解缓冲液Buffer CL，混匀后进行孵育处理得到裂解混合物；

S3.向裂解混合物中加入混有异丙醇的吸附结合液Buffer CB，混匀后冰浴3-5min，将混合溶液转入硅胶吸附柱进行负压抽滤；

S4.抽滤完成后，依次使用第一次清洗液Buffer GW1和第二次清洗液Buffer GW2和无水乙醇对硅胶吸附柱进行洗涤，离心处理后在室温条件下晾干，得到去除杂质的吸附有cfDNA的硅胶吸附柱；S5.加入20-150μL洗脱液Buffer EBL对硅胶吸附柱进行洗脱，离心收集洗脱液，得到cfDNA。

3.一种根据权利要求2所述的提取游离核酸的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤S2中，蛋白酶K的酶活浓度为20mg/mL。