[发明专利]一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法

说明书

本发明公开了一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，包括步骤：1)预处理：筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；2)初步研磨：将球状助研磨体加入步骤1)所得固态发酵曲料中，加入液氮并进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；3)在初步研磨后，将原料颗粒除去，得到菌体混合物；4)充分研磨步骤3)所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；5)向步骤4)所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。本发明的方法适用于从曲料等复杂基质中提取丝状真菌的总RNA，该方法提取的丝状真菌总RNA纯度高、完整性好。

技术领域

本发明涉及RNA提取技术领域，尤其是一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法。

背景技术

制曲是豆豉、酱油及豆酱发酵生产的必要过程，其中，酱油和豆酱的制曲过程是大豆、小麦等原材料在米曲霉、酱油曲霉等丝状真菌分泌的多种酶作用下被逐步降解的过程，其中米曲霉的使用最为广泛。在这个过程中，米曲霉分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，目前的研究集中于酶活等理化性质鉴定，但是对其深层分子机理和表达调控研究甚少，其中曲料中真菌总RNA的提取技术是分子机理和表达调控研究的基础。

现行的常规真菌总RNA提取方法主要包括CTAB法、热酚法、异硫氰酸胍法、Trizol法等，另外还可以使用柱离心法对RNA进行纯化。发明专利CN101638651B公布了一种改良Trizol法提取植物组织总RNA的方法，该方法特征在于用常规的Trizol法提取RNA后，加入氯仿/异戊醇再次抽提，并用异丙醇和醋酸钠沉淀RNA。该方法不适用于从曲料这种复杂基质中去除大豆、小麦大颗粒等成分，破碎菌丝细胞壁效率低，因此总RNA提取质量不佳。发明专利CN107267497B公布了一种通用型总RNA抽提试剂盒，改良的异硫氰酸胍法适用于植物根、果实等富含多酚、多糖的组织总RNA的提取，但是硅基质柱法无法满足曲料大培养体系抽提RNA的需要。

然而，常规的细胞总RNA提取方法不适用于曲料，曲料中总RNA难以提取的主要原因有三点：第一，对于固态发酵曲料而言，菌丝和孢子附着生长在曲料表面，常规提取方法难以实现分离及富集；第二，制曲过程中产生多种次级代谢产物，曲霉包含丰富的内源性RNase，导致提取过程有严重的RNA降解现象；第三，曲料中的丝状真菌的细胞壁结构包含几丁质、葡聚糖等难去除的多糖，RNA提取时能否有效的破壁严重影响RNA的提取质量。曲料中丝状真菌总RNA的提取尚未发展出成熟的技术，导致制曲基础研究的滞后。

从实验室水平的液体、固体培养基中提取RNA与从生产工艺水平的固态发酵曲料中提取RNA面临的困难有相似之处，也有很大区别。相同点在于：两者都必须将菌体与培养基质分离才能进行后续操作，其相似来自微生物培养体系的复杂性和现有核酸提取技术的原理限定；

不同点在于：实验室培养水平要分离菌体容易实现，从液体培养基中提取RNA可采用过滤法、而从固体培养基中提取RNA可采用直接刮取菌丝或用玻璃纸隔离，甚至改变培养介质和条件都能实现，而实验室培养体系下总RNA的提取方法不能直接套用在固态发酵曲料中真菌总RNA的提取，其原因有三：

1、生产工艺是固定的，不能改变制曲过程，只能从制备的成曲曲料着手；

2、RNA提取过程会改变RNA转录调控的状态，影响转录组测序的结果，最好的方式是原位处理提取，应避免使用复杂的前处理方法；

3、曲霉附着在曲料表面，虽然是好氧菌，但是其菌丝扎根向大豆内部生长，大豆、淀粉、菌体、孢子互相包裹粘黏，导致“去除培养基”成为主要的技术瓶颈。

CN101434630B、CN105779442B记载的方法准确描述应为“涡旋振荡+玻璃珠匀浆”。其核心在于利用高频振动破碎细胞，加入玻璃珠增加机械剪切力，如前所述，然而采用此类方法从固态发酵曲料中进行真菌总RNA的提取，不能获得合格的样品。