[发明专利]利用单一荧光通道聚合酶链反应设备的多重核酸检测方法

说明书

本发明提供一种利用TaqMan探针以及肽核酸(PNA)探针的在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中的多重核酸检测方法。本发明能够在混合使用设计为较低熔解温度(Tm)的肽核酸(PNA)探针以及TaqMan探针时在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中同时对2个基因进行检测，因此能够节省购买高价的多通道聚合酶连锁反应设备(PCR machine)所需要的费用支出，从而实现良好的经济性能。

技术领域

本发明涉及一种在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中对多种核酸进行检测的方法，尤其涉及一种利用肽核酸(PNA)探针以及TaqMan探针在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中对多种核酸进行检测的方法。

背景技术

伴随着实时聚合酶链反应设备(PCR machine)的问世，可以实时地对靶核酸进行扩增以及检测，最终成为了用于对靶以及生物标记的进行识别的核心工具并被广泛地应用于体外诊断、食品安全测试以及药物基因组学等多种应用领域。但是在生命科学产业，利用现有的实时聚合酶链反应(PCR)技术已经很难满足日益增加的对较高水准的多重核酸检测方法的需求。目前，通常使用配备4个以上荧光通道的高价实时聚合酶连锁反应设备(PCRmachine)或购买采用多重荧光标记探针的高价检测试剂盒并利用熔解曲线分析(Meltingcurve analysis)对靶核酸的检测进行确认。

虽然开发出了使用现有的实时聚合酶连锁反应设备(PCR machine)对靶基因进行多重检测的技术，但是在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中检测多重核酸的方法仍然具有通道内的干涉现象以及熔解温度(Tm)变化等诸多缺点。因此，急需开发出能够在目前使用的单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中克服通道内的干涉现象的多重核酸检测方法。

发明内容

本发明的发明人在对利用单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)检测2种基因的方法进行研究的过程中，着眼于因为肽核酸(PNA)探针与TaqMan探针同时经过核酸扩增过程且包含扩增过程中的信号，因此能够通过在扩增结束之后额外执行熔解曲线分析(Melting curve analysis)而检测出靶基因的特点，发现了利用TaqMan探针在扩增信号(Amplification plot)中检测出第1基因，并利用设计为较低熔解温度(Tm)值的肽核酸(PNA)探针检测出第2基因的方法。

因此，本发明的目的在于提供一种利用肽核酸(PNA)探针TaqMan探针在单一荧光通道聚合酶链反应设备中对2个基因进行检测的方法。

在本发明的一方面，提供一种在单一荧光通道聚合酶链反应设备中对2个基因进行检测的方法，包括：(a)利用第1基因的TaqMan探针以及第2基因的肽核酸(PNA)探针执行聚合酶链反应(PCR)的步骤；以及，(b)利用扩增信号(Amplification plot)对第1基因的检测进行确认，并利用熔解曲线分析(Melting curve analysis)对第2基因的检测进行确认的步骤。

在一个实施例中，步骤(a)中的上述TaqMan探针的使用浓度能够是1至10pmole/μl。

在一个实施例中，步骤(a)中的上述肽核酸(PNA)探针的熔解温度(Tm)值能够是30至60℃。

在一个实施例中，步骤(a)中的上述肽核酸(PNA)探针的使用浓度能够是5至50pmole/μl。

在一个实施例中，步骤(a)中的第2基因的正向(forward)引物与逆向(reverse)引物的引物比例为1:1。

在一个实施例中，提供一种检测方法，其特征在于：步骤(a)中的聚合酶链反应(PCR)是在95℃下执行3分钟之后再重复执行95℃(30秒)[变性(Denaturation)步骤]→55℃(30秒)[退火(Annealing)步骤]→72℃(30秒)[延伸(Extension)步骤]的过程。