[发明专利]利用源自舞蹈拟土地杆菌的岩藻糖基转移酶的2’-岩藻糖基乳糖的生产方法

说明书

本发明涉及一种从插入源自舞蹈拟土地杆菌(Pseudopedobacter saltans)的岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)的重组棒状杆菌属(Corynebacterium SP.)微生物中生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，本发明的插入源自舞蹈拟土地杆菌(Pseudopedobacter saltans)的岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)的重组棒状杆菌属(Corynebacterium SP.)微生物比常规大肠杆菌更安全，同时可以高浓度、高产率、高生产率生产2’‑岩藻糖基乳糖。

技术领域

本发明涉及一种2’-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL)的生产方法，更具体地，涉及一种从插入源自舞蹈拟土地杆菌(Pseudopedobacter saltans)的岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)的重组棒状杆菌属(Corynebacterium SP.)微生物中生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术

与其它哺乳类的乳汁相比，人的母乳中存在相当高浓度(5～15g/L)的200多种以上的具有独特结构的低聚糖(human milk oligosaccharides,HMO)。HMO由D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖(N-aetylglucosamine,GlcNAc)、L-岩藻糖(L-fucose,Fuc)和唾液酸(sialc acid)[Sia；N-acetyl neuraminic acid(Neu5Ac)]构成。

由于HMO的结构非常多样且复杂，因此具有其它残基和糖基化键的约200个异构体可能以相互不同的聚合度(DP 3-20)存在。然而，尽管结构复杂，HMO仍呈现几个共同的结构，其中，大部分HMO在还原端具有乳糖(Galβ1-4Glc)残基。乳糖的Gal可以以α-(2,3)-和α-(2,6)-键各自唾液化为3-唾液乳糖(3-sialyllactose)或6-唾液乳糖(6-sialyllactose)的形态，或者以α-(1,2)-和α-(1,3)-键各自岩藻糖基化(fucosylation)为2-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL)或3-岩藻糖基乳糖(3'-fucosyllactose,3-FL)的形态。

包括母乳中含量最高的三种低聚糖在内的137个被岩藻糖基化，其比率约为77％，而其余低聚糖大部分被唾液化(39个)，约为28％。其中，尤其，2-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖是提供有助于肠内乳酸菌生长的益生元(prebiotic)效果、预防病原菌感染、调节免疫系统以及对大脑发育等婴儿的发育以及健康具有积极影响的各种生物学活性的主要HMO，因此专家们强调婴儿期的母乳喂养非常重要。

但是，已知约20％的女性由于合成岩藻糖基低聚糖(fucosyl-oligosaccharides)的岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)的突变，在体内无法正常合成它们。因此，实际上需要岩藻糖基乳糖的产业化生产。

另一方面，作为岩藻糖基乳糖的生产方法，有直接从母乳提取的方法和通过化学或者酶方法合成的方法。直接提取的方法存在母乳供求限制和生产率低的问题，化学合成方法存在基质昂贵、异构体选择性(stereo-selectivity)和生产产率低以及有毒有机溶剂的使用等问题。并且，酶合成方法存在用作岩藻糖的供体(dornor)的GDP-L-fucose非常昂贵，岩藻糖基转移酶的提炼费用高的问题。

由于上述问题，直接提取、化学或酶生产方法难以应用于岩藻糖基乳糖的大量生产，作为该问题的解决方案，提出了利用微生物来生产2’-岩藻糖基乳糖的解决方案。利用微生物来生产2’-岩藻糖基乳糖的现有技术大部分是利用重组大肠杆菌生产的技术。但是，用于实验的大部分大肠杆菌实际上并不是病原菌，但消费者普遍认为是有害菌。

并且，大肠杆菌的细胞膜成分有可能起到内毒素作用，因此在生产2’-岩藻糖基乳糖时，分离提炼费用高。因此，目前还难以将大肠杆菌用作生产食品以及医药品的原材料，即岩藻糖基乳糖的宿主细胞。

发明内容