[发明专利]广义随机超分辨率测序

说明书

一种对多个多核苷酸进行测序的方法，包括：将单个DNA模板分子附着到样本容器上的多个附着元件的每个附着元件上，其中相邻元件之间的平均距离小于阿贝极限；同时对所有分子应用随机光切换化学，以使附着分子通过随机光切换在开和关事件中以多达四种不同的颜色发出荧光；以及在针对附着分子开和关事件发生时，实时对每种颜色的颜色通道中的开和关事件进行成像。

背景技术

生物学领域中的许多技术(包括用于DNA测序的技术)都受益于改进的成像系统和技术。DNA测序的早期途径包括双脱氧链终结法(即，Sanger测序)和化学降解法(即，Maxam-Gilbert测序)。对这些技术的更低成本和更快速备选技术的需求导致开发出了被已知为边合成边测序(Sequencing by Synthesis)(SBS)的整体测序方法。在该过程中，首先对单模板分子进行化学扩增，以生成具有相同序列的分子的表面结合“簇”。一旦产生簇，就开始测序，由此基于模板的序列来通过改性聚合酶添加荧光核苷酸。然后，通过光源激发簇，导致发射特征荧光信号，以确定碱基响应(base call)。然后，染料与3'链终结子一起除去，并且对序列中的下一碱基重复该循环。

发明内容

本文中所公开的技术的各种示例提供了用于超分辨率测序的方法和技术。在一个示例中，用于对多个多核苷酸进行测序的系统和方法包括：将单个DNA模板分子附着到样本容器上的多个附着元件中的每个附着元件上，其中相邻元件之间的平均距离小于阿贝极限；同时对所有分子应用随机光切换化学，以使附着分子通过随机光切换在开和关事件中以多达四种不同的颜色发出荧光；以及在针对附着分子开和关事件发生时，实时对每种颜色的颜色通道中的开和关事件进行成像。相邻元件之间的平均距离可以小于大约20nm，或者可以在约2nm至约20nm的范围内。

在另一示例中，一种对多核苷酸进行测序的方法可以包括：提供锚固到固相支持物的核苷酸序列阵列，其中相邻锚固件之间的平均距离小于阿贝极限；向阵列提供混合物，该混合物包括能够偶联核苷酸的酶、去屏蔽剂、与核苷酸链结合的核酸、以及多于一个的核苷酸类似物，该核苷酸链具有与锚固到固相支持物上的核苷酸序列互补的序列，该多于一个的核苷酸类似物包括碱基，碱基具有标记部分和与之结合的对应淬灭剂部分，其中标记部分与特定碱基部分相关；以及允许在混合物中经由多个反应循环向核酸中顺序添加多个核苷酸类似物，并发地对阵列内的标记部分进行成像；其中每个反应循环可以包括：(i)通过切割淬灭剂部分并且形成包括标记部分的瞬时核酸物质，聚合酶向核酸添加核苷酸类似物；以及(ii)去屏蔽剂改性瞬时核酸物质以除去标记部分的。在一些应用中，相邻锚固件之间的平均距离小于20nm。在其他应用中，相邻锚固件之间的平均距离在2nm至20nm的范围内。能够偶联核苷酸的酶可以包括聚合酶、肌球蛋白或激酶。

核苷酸类似物可以包括具有3'碳的戊糖部分，并且标记部分可以在3'碳处附着到核苷酸。在另一示例中，核苷酸类似物可以包括三磷酸部分，并且淬灭剂部分可以附着到三磷酸盐部分。

在一些应用中，去屏蔽剂可以包括磷酸酯酶(例如，磷酸二酯酶、磷酸三酯酶等)。可以包括磷酸酯酶以从瞬时核酸物质中选择性除去磷酸二酯部分或磷酸三酯部分。磷酸酯酶可以选自由核酸内切酶IV和AP核酸内切酶组成的组。

作为示例，在去屏蔽剂改性瞬时核酸物质以除去标记部分之前，瞬时核酸物质可以存在至少1毫秒。作为另一示例，在去屏蔽剂改性瞬时核酸物质以除去标记部分之前，瞬时核酸物质可以存在不超过30秒。

在各种应用中，多个反应循环可以包括至少100个反应循环，由此通过添加至少100个核苷酸类似物来延伸核酸。在各种应用中，能够偶联核苷酸的酶包括聚合酶、肌球蛋白或激酶。