[发明专利]突变细胞游离基因分离试剂盒及利用其的突变细胞游离基因分离方法

权利要求书

1.一种突变细胞游离基因分离用试剂盒，包括：

包含5’末端被保护的引物的野生型细胞游离基因及突变细胞游离基因扩增用组合物；

所述野生型细胞游离基因特异性导向RNA；

用于切割所述野生型细胞游离基因的Cas蛋白质；及

用于去除所述野生型细胞游离基因的核酸外切酶。

2.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，其中，

所述突变细胞游离基因为包含癌特异性突变的DNA，

所述试剂盒用于从分离自癌疑似个体的血液、血浆或尿液试料中包含的野生型细胞游离基因及突变细胞游离基因中分离突变细胞游离基因。

3.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，

所述Cas蛋白质为酿脓链球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、巴氏链球菌、空肠弯曲菌Cas9、金黄色葡萄球菌、新凶手弗朗西斯菌Cas9、灰色奈瑟球菌Cas9、脑膜炎奈瑟菌Cas9普氏菌或弗郎西丝菌1。

4.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒

所述导向RNA为包括crRNA及tracrRNA的双重RNA或sgRNA。

5.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，其中，

所述导向RNA包含多个野生型细胞游离基因特异性2种类以上的导向RNA。

6.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，其中，

所述5'末端被保护的引物是所述引物的5'末端被用硫代磷酸酯键保护，所述基因扩增用组合物为PCR组合物。

7.一种突变基因型分析方法，包括：

i)利用5'末端被保护的引物，将包括至少一个野生型细胞游离基因及至少一个突变细胞游离基因的分离试料内的所述野生型细胞游离基因与突变细胞游离基因扩增的步骤；

ii)进行特异性地结合于所述野生型细胞游离基因的导向RNA及Cas蛋白质处理，只切割所述扩增的野生型细胞游离基因的步骤；

iii)对所述突变细胞游离基因、所述切割的细胞游离基因存在的试料进行核酸外切酶处理，只去除所述切割的野生型细胞游离基因的步骤；

iv)扩增所述试料内留下的突变细胞游离基因的步骤；及

v)分析所述扩增的突变细胞游离基因的步骤。

8.根据权利要求7所述的突变基因型分析方法，其中，

所述i)包含至少一个野生型细胞游离基因及至少一个突变细胞游离基因的分离试料，是从癌疑似个体分离的血液、血浆或尿液试料。

9.根据权利要求7所述的突变基因型分析方法，其中，

所述突变细胞游离基因为包含癌特异性突变的DNA，

所述突变细胞游离基因分析，用于提供癌诊断所需的信息。

10.根据权利要求7所述的突变基因型分析方法，其中，

所述5'末端被保护的引物，是所述引物的5'末端被用硫代磷酸酯键保护。

11.根据权利要求7所述的突变基因型分析方法，其中，

所述Cas蛋白质为酿脓链球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、巴氏链球菌、空肠弯曲菌Cas9、金黄色葡萄球菌、新凶手弗朗西斯菌Cas9、灰色奈瑟球菌Cas9、脑膜炎奈瑟菌Cas9普氏菌或弗郎西丝菌1。

12.根据权利要求7所述的突变基因型分析方法，其中，

所述导向RNA为包含crRNA及tracrRNA的双重RNA或sgRNA。

13.根据权利要求7所述的突变基因型分析方法，其中，

所述扩增利用PCR执行。