[发明专利]用于确定微生物浓度的方法

权利要求书

1.一种从包含微生物和哺乳动物细胞的样品制备完整微生物的悬浮液的方法，所述方法包括：

a.提供包含微生物和哺乳动物细胞的样品；

b.使所述样品与缓冲溶液、洗涤剂和一种或多种蛋白酶接触，其中所述缓冲溶液的pH为至少pH 6且小于pH 9，以裂解存在于所述样品中的哺乳动物细胞；

c.通过适合保留微生物的过滤器过滤步骤(b)中获得的混合物，其中所述过滤从所述混合物去除裂解的哺乳动物细胞；

d.回收步骤(c)中通过所述过滤器保留的微生物，其中所述回收包括将所述微生物重悬在液体中以提供包含回收的完整微生物的悬浮液；和

e.确定所述悬浮液中微生物的浓度，其中微生物的浓度通过包括以下的方法确定：

i.使所述悬浮液的等分试样与醇接触和/或加热所述悬浮液的等分试样；

ii.任选地稀释所述悬浮液的一个或多个等分试样以提供处于一个或多个稀释值的一个或多个稀释的等分试样，其中所述稀释在步骤(i)之前、期间和/或之后进行；

iii.使步骤(e)(i)或(e)(ii)的等分试样的至少一部分与能够结合DNA的单一荧光染色剂接触，以提供悬浮液-染色剂混合物，其中所述染色剂具有发射波长；

iv.在所述荧光染色剂的所述发射波长下对步骤(e)(iii)的所述悬浮液-染色剂混合物进行成像，并确定成像混合物中对应于微生物的物体的数目的图像分析值；和

v.将步骤(e)(iii)的所述等分试样的在步骤(e)(iv)中获得的图像分析值与预定的校准曲线进行比较，从而确定所述悬浮液中微生物的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括步骤(f)，调节所述悬浮液的至少一部分中的微生物的浓度。

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(f)包括在确定所述悬浮液中的微生物的浓度之前调节所述悬浮液的至少一部分中的微生物的浓度。

4.根据权利要求2或3的方法，其中步骤(f)包括在步骤(e)中确定浓度之后调节所述悬浮液的至少一部分中的微生物的浓度。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中通过稀释调节所述浓度。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(e)(iii)的所述染色剂是细胞可渗透的染色剂。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述样品是临床或兽医样品或者临床或兽医样品的培养物。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述缓冲溶液为pH 6.5至8.5，或者pH6.5至8或7至8。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述缓冲溶液为pH 7.5。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是非离子洗涤剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述非离子洗涤剂是Brij-O10。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂的浓度在0.1至5％w/v之间，或者在0.1至1％w/v之间。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述洗涤剂的浓度为0.45％w/v。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶是蛋白酶K。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括使所述样品与包含以下的组合物接触：(i)包含PBS pH 7.5、0.45％w/v Brij-O10的裂解缓冲液，和(ii)蛋白酶K。