[发明专利]用于确定从全血分离血浆的效率的方法和试剂盒在审

专利信息
申请号: 201980013775.3 申请日: 2019-02-20
公开(公告)号: CN111742058A 公开(公告)日: 2020-10-02
发明(设计)人: 丹尼·弗鲁姆金;亚当·瓦瑟斯特罗姆;莉薇特丽·克尼尔什 申请(专利权)人: 纽克莱克斯有限公司
主分类号: C12Q1/6851 分类号: C12Q1/6851;C12Q1/686
代理公司: 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 代理人: 李敏春;郑霞
地址: 以色列*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 用于 确定 分离 血浆 效率 方法 试剂盒
【说明书】:

提供了用于使用实时PCR扩增两种扩增子来确定从全血分离血浆的效率的方法和试剂盒,所述两种扩增子即短扩增子和长扩增子,短扩增子例如70‑150bp的,长扩增子例如350‑600bp的。分离效率基于这两种扩增子的扩增模式的差异来确定。

发明领域

本发明涉及用于评估血浆样品是否与全血的细胞级分(the cellular fractionof whole blood)充分分离的实时PCR测定。本发明对于需要利用循环无细胞DNA的诊断测试是有利的。

发明背景

循环无细胞DNA(cfDNA)是由正常细胞和肿瘤细胞两者释放到血液循环中的DNA。血液中cfDNA的来源尚未完全了解,但是认为与细胞凋亡、坏死以及从细胞主动释放相关。几十年前就已经知道血液中存在cfDNA,但是仅在最近几年才认识到其真正的诊断潜力,导致对cfDNA的检测和分析越来越感兴趣。例如,现在母体血液中存在的胎儿cfDNA被用于非侵入性产前诊断,并且使用肿瘤来源的cfDNA作为癌症患者的替代标志物的临床研究正在进行。

分析cfDNA首先需要从全血分离血浆(含有cfDNA)。通常通过离心或过滤从血液分离血浆。目前较新的微流体方法正在出现。分离后,可以通过提取进一步纯化cfDNA,然后进一步分析。

将cfDNA与血液的细胞级分有效分离对cfDNA分析的质量高度重要。在抽血的时间和处理血浆的时间之间,血浆被从白细胞释放的DNA污染,降低了样品中cfDNA的比例,并且增加了cfDNA分析的噪音和不准确性。为了评估分离效率,通常使用血细胞计数器手动进行或使用流式细胞仪自动进行血细胞计数。然而,这样的方法有许多缺点,其中一些费力并且昂贵,而其他的不够准确。

研究显示,循环cfDNA大部分是长度小于300bp和长度甚至小于200bp的片段(Chan等人,2004,Clinical Chemistry,50(1):88-92),而来源于白细胞的DNA大部分是大于10Kb的长片段。

通过检测长DNA片段相比于短DNA片段的存在,基于分子大小分离DNA的凝胶电泳已经被建议用于确定分离效率。然而,这样的方法需要大量的DNA,这是在处理循环无细胞DNA时的一个主要困难。

Norton等人(2013,Clinical Biochemistry,46:1561-1565)研究了稳定剂在血液样品储存和运输期间防止无细胞DNA(cfDNA)被细胞基因组DNA(gDNA)污染的能力。gDNA的污染使用数字PCR来评估。特别地,利用数字PCR技术通过从β-肌动蛋白基因扩增420bp的DNA片段来定量污染性gDNA。利用第二数字PCR测定通过扩增136bp的更短的β-肌动蛋白扩增子来定量cfDNA。使用这些测定来确定血浆cfDNA样品的质量,以评估gDNA污染的程度。

对于用于确定从全血分离血浆的效率的操作简单、成本有效且准确的改进的方法和试剂盒存在需求。

发明概述

根据一些方面,本发明提供了用于使用定量PCR扩增两种扩增子来确定从全血分离血浆的效率的方法和试剂盒,所述两种扩增子即短扩增子和长扩增子,短扩增子例如70-150bp的,长扩增子例如350-600bp的。分离效率基于这两种扩增子的扩增水平的差异来确定。有利地,分离效率的确定不需要对DNA绝对定量和/或确定任何基因/基因座的拷贝数。

血液的血浆级分中的DNA大部分是无细胞DNA的短片段,长度最大约300bp。当血浆级分未与血液的细胞组分充分分离时,血浆还含有来源于白细胞的DNA。后者大部分是大于10Kb的长片段。因此,血浆样品中DNA长片段的存在提供了对于从全血分离血浆的效率的指示。

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