[发明专利]单细胞冻融裂解在审
| 申请号： | 201980015170.8 | 申请日： | 2019-02-22 |
| 公开（公告）号： | CN112236518A | 公开（公告）日： | 2021-01-15 |
| 发明（设计）人： | R·范;B·杜拉 | 申请（专利权）人： | 耶鲁大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12Q1/6844;C12Q1/6806;C12N15/11;C40B70/00 |
| 代理公司： | 上海一平知识产权代理有限公司 31266 | 代理人： | 王正君;徐迅 |
| 地址： | 美国康*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 单细胞 裂解 | ||
1.一种高通量单细胞mRNA谱分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将细胞、条形码化的mRNA捕获珠以及任选的冻融缓冲液上样到微孔阵列上；
用盖密封微孔阵列，并产生密封的微孔阵列，其包括上样的细胞和条形码化的mRNA捕获珠；
冻融密封的微孔阵列，从而裂解细胞并从细胞中释放mRNA，其中在不存在裂解缓冲液的情况下裂解细胞；
收集条形码化的mRNA捕获珠并分离条形码化的珠捕获的mRNA；和
对mRNA进行测序。
2.一种高通量单细胞mRNA谱分析方法，其特征在于，所述方法包括：
将细胞、条形码化的mRNA捕获珠和任选的冻融缓冲液上样到与微流体通道结合的微孔阵列上，并产生包含上样的细胞和条形码化的mRNA捕获珠的密封微孔阵列；
冻融密封的微孔阵列，从而裂解细胞并从细胞中释放mRNA，其中在不存在裂解缓冲液的情况下裂解细胞；
收集条形码化的mRNA捕获珠并分离条形码化的珠捕获的mRNA；和
对mRNA进行测序。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述条形码化的mRNA捕获珠的直径为20μm-50μm或35μm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述微孔阵列包括直径(宽度)为40μm-60μm或50μm的微孔。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述微孔阵列包括1,000个微孔-100,000个微孔，或15,000个微孔-70,000个微孔。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，将100个细胞-20,000个细胞，或1,000个细胞-5,000个细胞上样到微孔阵列上。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述微孔阵列以5％至10％的孔占有率上样。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，大于80％或大于90％的阵列微孔包含单个条形码的mRNA捕获珠。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述条形码化的mRNA捕获珠通过离心收集。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述冻融缓冲液不包含去污剂(例如Triton X-100、NP-40或SDS)或其他裂解试剂。
11.如权利要求1-10中的任一项所述的方法，其特征在于，所述冻融缓冲液包括高渗溶液。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述冻融缓冲液包含选自Tris、EDTA、NaCl、DTT和RNase的至少一种试剂。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述冻融缓冲液包含Tris、EDTA、NaCl、DTT和RNase。
14.如权利要求1或3-13任一项所述的方法，其特征在于，将微孔阵列密封而不使用半透(纳米多孔)膜。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述冻融步骤包括将密封的微孔阵列在-80℃下冷冻。
16.如权利要求1-15中的任一项所述的方法，其特征在于，所述冻融步骤被重复至少两次。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是分离的原代细胞。
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