[发明专利]用于防止特定染色体的传播的材料和方法

说明书

本文提供了用于改变选择的性染色体中的基因表达的材料和方法。本发明的材料和方法可用于生产产生预定性别的子代的非人转基因动物和生成产生单性精液的非人转基因动物。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年2月26日提交的美国临时申请号62/635,270的权益，其通过引用以其整体并入本文。

ASCII文本文件的序列表的提交

以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：186122000940SEQLIST.txt，记录日期：2019年2月26日，大小：20KB)。

技术领域

本发明涉及牲畜中的性别规范、防止Y染色体的传播以及与传播比率失真(TRD)和防止(或确保)其他染色体的传播相关的其他用途的领域。

背景技术

性别确定是牲畜中的重要问题。在许多畜牧产业中，产生特定性别(通常雌性)的后代的能力具有高的商业价值。例如，奶牛产业偏爱雌性后代。其他类型的牲畜操作也有偏爱，以便避免与绝育相关的问题，或以便确保更大的雄性后代，例如，在肉类工业中。

分离的高纯度携带X染色体或携带Y染色体的精细胞(sperm cells)群体可用于完成许多哺乳动物，比如，牛科动物、马科动物、羊属动物(ovids)、山羊、猪、狗、猫、骆驼、大象、公牛、水牛等的卵细胞或卵母细胞的体外或体内人工授精或受精。

基于携带X染色体和Y染色体的精细胞的大小、质量或密度的差异，已经设计了许多技术以直接地或间接地分离精子。然而，几乎所有这些方法都是基于精液的机械分选，并且有可能损坏精细胞，从而降低妊娠率并增加成本。此外，例如，由于精细胞中存在的DNA染色的量，由于染色程序而流逝的时间，以及受精的卵母细胞向囊胚形成的减缓进展，精子DNA的染色可对受精率有不利的影响。另外，精细胞选择的纯度可受到携带X和Y染色体的精细胞群体中荧光染料DNA染色模式的重叠范围的不利影响。

控制性别确定，即启动‘雄性’或‘雌性’级联(cascade)的基因是已知的并且经鉴定的。然而，使用这些基因的方法产生了次最优的结果，因为，例如，所得动物失去了许多与性别有关的特征，并且看起来比真正的强迫性性别更雌雄同体或具有混合的表型。

其他方法使用位点特异性核酸酶比如CRISPR攻击Y染色体并且阻止其传播。由于在一些情况下没有裂解或在其他情况下通过非同源端连接的裂解修复，这些方法因为它们中等的整体效率而具有实践问题，并且具有潜在的监管问题。

精子发生和胞质桥

在生产单性动物中造成困难的一个方面是这样的事实，在精子发生期间，胞质分裂是不完全的，并且由相同的未分化的精原细胞产生的生殖细胞仍通过细胞间桥彼此连接，细胞间桥一直保持到晚期精子发生。

在所有哺乳类物种中，精子发生主要发生在睾丸的生精小管中。其大致发生在“外部”，其中发育的最早阶段在小管的边缘附近，并且最后阶段在中心附近，成熟的精子释放至小管的中心。精子发生中的初始细胞是精原干细胞。这些干细胞能够自我更新并且分化成精原细胞。有几轮有丝分裂增殖，接着是其中染色体对分开的减数分裂I，并且然后接着是其中染色单体分离成单倍体精细胞的减数分裂II。重要的是，在整个该过程中，精子都通过胞质桥连接，RNA和蛋白质均通过胞质桥自由扩散。因此，精细胞共享横跨胞质桥的转录物和/或基因产物。

在精子发生的最后阶段，精细胞伸长，胞质桥断裂；尽管它们保持在残留体中。到此时，随着染色质被浓缩成精子头，转录被关闭。因此，精子(sperm)在它们的整代中功能上主要是二倍体的，即使在减数分裂II之后它们具有单倍体基因组。