[发明专利]用于在低于正常冻结温度时测量水溶液中的生物材料的降解动力的设备和方法

说明书

本公开描述了一种用于在低于正常冻结温度时测量水溶液中的生物材料的降解动力的设备和方法。还包括如下新型系统，该新型系统包括：具有成核锁的高压容器；用于高压容器的温度控制保持器；用于成核锁的保持器以及隔热低温梯度室。所描述的方法包括一些步骤，诸如：用生物材料溶液填充高压容器，并使生物材料溶液略低于冻结温度，用低于冻结温度的成核锁关闭容器，使容器达到反应温度，在选定的时间移除容器并且使其高于冻结温度，以及打开容器以回收生物材料溶液。

技术领域

本公开总体上涉及一种用于在低于正常冻结温度时测量水溶液中的生物材料的降解动力的设备和方法。

背景技术

对于蛋白质在实验室环境与用于商业生物技术产品二者中的保存来说，蛋白质聚集是长期存在的问题。该问题在蛋白质的制造和储存期间是频繁出现的问题，并且可能引起免疫原性(小聚集体)或投药时的潜在问题(大聚集体)。因此，作为药品开发过程的一部分，调配师(regulator)需要进行稳定性研究以证明分子在其生产途径和保存期限内持续安全有效。各种制剂的稳定性通常通过实时稳定性研究与加速稳定性研究的结合来评估。然而，通常难以通过常见的“加速”条件来预测在长期或短期冷藏期间的聚集。

最近，提出如下加速方法(加快方法，expedite method)来加速蛋白质的冷变性，该方法通过将生物材料溶液在等容条件下在高压容器中冷却到低于其冻结温度来防止冰的形成(Rosa等，2013)。

由Rosa等(2013)描述的方法具有改进用于加速研究的习惯作法的潜力，该方法主要包括增加制剂的温度(通常高于50℃)以获得在合理的时间尺度(从数小时至数周)下的降解速率。关于通过增加温度的经典加速稳定性实验的普遍问题在于通过线性阿伦尼乌斯推断(linear Arrhenius extrapolation)得到实际冷藏温度，这可能大大高估蛋白质溶液的低温稳定性(Brummitt等，2011；Rosa等，2017)。希望蛋白质不会由于从最大稳定值增加或降低温度而折叠。出于这个原因，通过能够在低于冻结温度而水不结晶的条件下进行实验，人们可在低温时进行加速稳定性研究，由此消除了在大温度范围内推断结果的需要，从而最小化了非阿伦尼乌斯行为的影响。

因此，由Rosa等(2013)开发的等容冷却方法具有如下潜力：使蛋白质降解途径清楚以及有助于开发更好的制剂以用于提高蛋白质稳定性。

虽然已经建立了等容方法的基本构思，但是在Rosa等(2013)提出的方法能够通用之前必须克服若干限制。在研究发展期间已经进一步认识到关于等容方法的未预期的问题，并且随后对其进行描述。Rosa等(2013)强调，冰种(冰种晶，ice seed)的插入对于确保发生受控的成核是必要的，并且当容器完全充满液体时冰种将提供自然活塞。当温度降低时，低密度冰试图生长，而因此需压缩溶液使得压力升高并且抑制冻结线，由此能够有效地避免溶液冻结。否则，一旦发生不受控的成核，压力可能突然上升，这对蛋白质稳定性和实验的再现性具有不利的影响。作者还使用具有大长径比(长度/直径)的高压容器，这种高压容器重、难以关闭/打开、非常难以清洁和消毒并且因此耗时且再现性差。此外，需要对长管状钢容器进行视觉检查和用户实验以确保在添加生物材料溶液之后没有空气留在内部(否则水可能膨胀和冻结)，并且确保在填充过程中以及即使在高于冻结温度的状态下操作容器时冰种不解冻。然而，Rosa等(2013)没有描述如何确保实现这些关键问题，例如，如何确保冰种在高于冻结温度的状态下与药物制剂混合时保持冻结。已经提出了一些控制冰成核的技术，例如，将小冰晶或冰的异质成核剂引入样品；通过在容器外部手动产生冷点；通过电冻结；通过机械方法(震动、施加超声)；通过骤冷或压力变化。尽管已经开发了多种方法，但大多数难以标准化并且难以具有再现性地集成到多个小体积容器中。此外，描述的大多数改进冰成核的方法使用大于10mL的体积，并且在所提出的等容方法中使用时具有一些缺点。例如，向样品中添加外部颗粒可能影响聚集动力、难以使用探针、所有溶液在容器关闭之前就可能冻结以及机械方法影响再现性。

Rosa等提出的等容方法通过以下8个步骤实现，即：

(1)在室温附近用固定体积的水填充容器；