[发明专利]一种具有更高特异性的核酸扩增方法

权利要求书

1.一种用于扩增核酸的方法(图56)，其中：

·样品包含第一核酸聚合物，该第一核酸聚合物包含第一靶序列M1[以及与M1(反向)互补的序列M1’]，其中M在5’-3’方向包含连续的序列片段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1，且在第一扩增步骤中与以下组分接触：

·第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子(尤其是镁离子)；

·第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含连续的序列片段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有与M1.1互补[可基本上序列特异性地结合]的[杂交]序列，而序列区段P1.1.2不能与M1[或相对于序列M1紧随3’方向上M1.1的序列]结合；

其中，P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；

·第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其与M1.5(基本)相同[并且能够序列特异性地与M1的反链上的M1.5的反向互补序列或P1.1的延伸产物P1.1-Ext(该处称为P1.1E1)结合]；以及

·对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的序列片段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3与M1的区段M1.2相同，且区段M1.2位于M1.1的5’方向上[并且在P1.1的聚合酶启动时首先被读取，因此C1.2.3可以与引物P1.1-Ext的聚合产物结合]，C1.2.2与P1.1.1互补(且与M1.1相同)，而C1.2.1与P1.1.2互补；

其中，C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；

其中，所述样品在第二扩增步骤中与下列组分接触：

c)第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其在3’末端包含序列区段3.1.1[或基本上由3.1.1组成]，且与M1的M1.1(反向)互补[可以与P2.1-Ext互补地结合]；

d)第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列区段4.1.1[或基本上由4.1.1组成]，且与M1的M1.5相同和/或基本相同[可以与P1.1-Ext互补地结合]；以及

e)第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子。

2.如权利要求1所述的用于扩增核酸的方法，其中获得了第一引物延伸产物P1.1-Ext，其在5’-3’方向上除了序列区域P1.1.2和P1.1.1之外，还包括在5’-3’方向上包含序列片段P1.1E4、P1.1E3、P1.1E2和P1.1E1的合成区域，其中P1.1E4与靶序列M1的序列区段M1.2基本互补，P1.1E3与M1.3基本互补，P1.1E2与M1.4基本互补，以及P1.1E1与M1.5基本互补，并且得到第二引物延伸产物P2.1-Ext，其除了序列区域P2.1.1之外还包含合成区域P2.1-Ext，其与所述靶序列M1基本相同，且所述靶序列M1所在的区域与3’方向上的M1.5相邻；

其中：

-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者

-选择P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果适用)的长度和/或解链温度，

以使P1.1-Ext可以与M1或P2.1-Ext形成双链，而P1.1-Ext可以与C1.2形成双链，并且P1.1-Ext与C1.2形成的所述双链优选于其与P2.1-Ext形成的所述双链。

3.如权利要求2所述的用于扩增核酸的方法，其中：

-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者

-选择P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果适用)的长度和/或解链温度，

以使在没有所述对照寡核苷酸C1.2的情况下，所述第一引物延伸产物P1.1-Ext根本或基本不与所述第二引物延伸产物P2.1-Ext分离。

4.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述修饰的核苷酸结构单元包括2’-O-烷基核糖核苷结构单元，尤其是2’-O-甲基核糖核苷结构单元。