[发明专利]具有极低的错误水平的dsDNA有效测序

权利要求书

1.一种用于DNA测序的方法，其包括：

a)在以下条件下将dsDNA片段与Y-衔接子和包含亲和标记的发夹衔接子组合，其中所述衔接子连接到片段，形成侧接两个Y-衔接子的片段插入物(YY)、侧接Y-衔接子和发夹衔接子的片段插入物(发夹)和侧接两个发夹衔接子的片段插入物(哑铃)的混合物；

b)用选择用于所述Y-衔接子的测序引物对选择的片段插入物进行测序。

2.权利要求1所述的方法，其中所述测序是双端或长读测序。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述混合物包含大约相等的Y-衔接子和发夹衔接子，其中所述混合物中所得的连接产物为约1:2:1，并且所述方法还包括在测序步骤之前选择或富集标记的片段插入物。

4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述混合物包含与Y-衔接子相比，足以避免在测序步骤之前对选择步骤的需要的过量的发夹衔接子其。

5.权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述dsDNA片段包含平末端，所述平末端任选地通过添加单碱基，例如通过dA或dT加尾进行修饰。

6.权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述dsDNA片段包含非平末端，所述非平末端任选地通过消化和部分补平(fill-in)而产生。

7.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中步骤(b)还包括通过亲和杂交对发夹进行亲和富集并去除未杂交的哑铃。

8.权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其还包括用选择用于所述Y-衔接子的引物扩增富集或选择的片段，任选地引入索引衔接子，以及任选地进行另外的选择，例如使用基因特异性探针进行另外的选择。

9.权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的方法，其中所述Y-衔接子包含促进所述Y-衔接子的茎上的错配的碱基，所述错配足以弱化所述发夹的拉链闭合并通过测序引物促进退火过程(access)，其中所述促进错配的碱基是氧代-G或通用碱基，如5-硝基吲哚和肌苷。

10.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的方法，其中所述Y-衔接子包含通用碱基或在桥式扩增或PCR扩增之前有效促进供选择的配对的碱基，以获得具有较低的形成延伸到测序衔接子退火的标准序列之外的拉链的倾向的区域。

11.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10所述的方法，其中步骤(b)包括使用由延伸超过所述发夹茎的串联重复序列提供的诱饵来产生另一个与所述拉链的形成竞争的靶标。

12.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的方法，其中步骤(b)包括使用由延伸超过所述发夹茎的串联重复序列提供的诱饵来产生另一个与所述拉链的形成竞争的靶标，其中所述诱饵与所述发夹中与所述测序引物相互作用的部分互补，以确保所述发夹不能有效闭合。

13.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12所述的方法，其中步骤(b)包括使用由延伸超过所述发夹茎的串联重复序列提供的诱饵来产生另一个与所述拉链的形成竞争的靶标，其中所述诱饵提供与所述测序引物的减弱的杂交，并且延伸到所述测序引物的区域外部。

14.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所述的方法，其中步骤(b)包括使用由延伸超过所述发夹茎的串联重复序列提供的诱饵来产生另一个与所述拉链的形成竞争的靶标，其中所述诱饵是不完美的串联重复序列，如在具有互补性的13bp区域，通常为13bp区域具有不完美的碱基配对，例如使用G-T碱基配对。

15.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的方法，其中步骤(c)包括在所述发夹的茎的外部部分或完全杂交所述测序引物。