[发明专利]用于寡核苷酸治疗剂的大规模平行发现方法

权利要求书

1.一种用于对修饰的寡核苷酸的核碱基序列进行测序的方法，所述修饰的寡核苷酸例如2'糖修饰的寡核苷酸诸如LNA或2'-O-甲氧基乙基修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸，所述方法包括以下步骤：

Ⅲ.从所述2'糖修饰的寡核苷酸进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生包含所述2'糖修饰的寡核苷酸的互补序列的核酸序列；

Ⅳ.对在步骤II中获得的第一链合成产物进行基于引物的测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤I之后和在步骤II之前，将步骤I的所述第一链产物进行PCR扩增。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤II包括在所述基于引物的测序之前对所述第一链合成产物或PCR扩增产物进行克隆扩增。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法用于对修饰的寡核苷酸样本中存在的修饰的寡核苷酸种类群体内的多个修饰的寡核苷酸种类进行平行测序。

5.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述聚合酶介导的5'-3'第一链合成之前，将与所述修饰的寡核苷酸的3'区域互补的第一引物与所述修饰的寡核苷酸杂交以引发所述5'-3'第一链合成。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述聚合酶介导的5'-3'第一链合成之前，将所述修饰的寡核苷酸连接至3'捕获探针，所述3'捕获探针是自引发捕获探针或包含第一引物结合位点。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在所述第一链合成步骤之前，将第一引物与所述3'捕获探针杂交，以引发所述聚合酶介导的第一链合成。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中在将所述3'捕获探针连接至所述修饰的寡核苷酸之后且在所述第一链合成之前，将连接产物纯化，例如通过凝胶纯化或通过未连接的3'捕获探针的酶促降解。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述PCR步骤是使用PCR引物对进行的，其中所述PCR引物中的一条引物对所述3'捕获探针是特异的，并且第二PCR引物对所述修饰的寡核苷酸例如所述修饰的寡核苷酸的5'区域是特异的。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述测序步骤II包括使用克隆扩增引物对步骤I的所述第一链产物进行克隆扩增，其中所述克隆扩增引物中的一条引物对所述3'捕获探针是特异的，并且第二克隆扩增引物对所述修饰的寡核苷酸例如所述修饰的寡核苷酸的5'区域是特异的。

11.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中在所述第一链合成步骤I之后以及如果进行第一链合成产物纯化，则将衔接子探针连接在所述第一链合成产物的3'端。

12.根据权利要求11所述的方法，其中使用一对PCR引物进行所述PCR步骤，其中所述PCR引物中的一条引物对所述3'捕获探针是特异的，并且另一条PCR引物对所述衔接子探针是特异的。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述测序步骤II包括使用分别对所述3'捕获探针和所述衔接子探针特异的克隆扩增引物对步骤I的所述第一链合成产物进行所述克隆扩增。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在第一链合成之后，将所述第一链合成产物聚腺苷酸化。

15.根据权利要求14所述的方法，其中使用聚T引物从所述第一链合成第二链。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述聚T引物进一步包含PCR引物结合位点和/或克隆扩增引物结合位点。