[发明专利]无细胞DNA染色质免疫沉淀的诊断应用

说明书

提供了确定无细胞DNA(cfDNA)的来源、用于检测对象中细胞类型或组织的死亡、用于确定细胞在其死亡时细胞状态及其组合的方法。还提供了用于这些的计算机程序产品。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月13日提交的美国临时专利申请号62/642,158和2018年5月6日提交的美国临时专利申请号62/667,528的优先权权益，其整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明属于无细胞DNA-蛋白质复合物分析领域。

背景技术

细胞死亡(通过凋亡或坏死)后，短DNA片段被释放到血浆中。这些通常被称为循环无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA(ctDNA，如果源自肿瘤细胞)。cfDNA的存在已被认知数十年，其中cfDNA片段的一般长度为约～166bp的倍数——单核小体DNA的长度(～146bp)，并带有一些另外的连接体DNA。健康人的血浆包含～1000个基因组/ml的等同量，并且上至100倍多的cfDNA存在于很多病理情况(例如癌症)和一些生理状况(例如运动后)中。这些片段寿命短，并且估测半衰期短于1小时，使其成为以无创方式监测生理和病理过程的理想生物标记。近年来，cfDNA作为诊断工具的使用已大幅扩展。例如，现在将母体血液中胎儿cfDNA的下一代测序技术用于无创的染色体异常和亲本源突变的产前筛查/诊断。由于血液样品中存在的cfDNA量非常低，大多数当前的cfDNA诊断方法都依赖于cfDNA的突变来将其与健康组织和血细胞中的cfDNA区分。事实上，到目前为止，血细胞cfDNA是cfDNA总库的最大贡献者，并且可使其他组织的状况的cfDNA诊断变得困难。

大多数当前基于cfDNA的方法都依赖于检测cfDNA中的基因组变化，以定量基因组序列(如胎儿、移植物、或肿瘤突变基因)改变的细胞的cfDNA的贡献。因此，这些方法偏重一组预选的基因，而无视涉及基因组与宿主基因组相同的细胞的周转(turnover)和死亡的事件。最近的方法利用了无细胞DNA中的表观遗传信息。总cfDNA的极深测序可提供反映来源组织和基因表达的数据。但是，其依赖于检测目标区域覆盖率的变化，其中源组织的信号被强加在正常细胞的背景上(例如，在10％的细胞中导致核小体耗竭的事件的检测需要区分90％占据与100％占据)。因此，这种方法通过利用极深的测序覆盖(每个样品几亿个读段)来避免采样噪声。即使有这样的测序深度，对于稀有亚组的细胞中的事件也存在严格的苛刻检测限制。一种有前景的替代方法是测定沿着序列的DNA CpG甲基化以鉴定来源细胞。DNA甲基化充当稳定的表观遗传记忆，并且在分化后大部分保持不变。因此，其关于细胞谱系提供很多信息，但关于表达的瞬时变化以及源自相近或相似谱系的细胞却很少。此外，DNA甲基化的无偏分析需要高测序深度，因为大多数CpG都是甲基化的。

允许准确确定cfDNA来源并提供关于细胞中接近细胞死亡时发生的分子事件的信息的方法将不仅允许对医生或患者未知的状况的早期诊断，而且还可有助于根据新发现疾病调整治疗。

发明内容

本发明提供了确定无细胞DNA(cfDNA)的来源、检测细胞类型或组织的死亡、确定对象中的细胞的细胞状态及其组合的方法，其通过对通过提取蛋白质以及与cfDNA结合的修饰蛋白质分离出的该cfDNA测序而进行。还提供了用于这样做的计算机程序产品。

根据第一方面，提供了确定释放其DNA的细胞的细胞状态、来源组织、细胞类型或其组合的方法，包括：

a.提供样品，其中所述样品包含无细胞DNA(cfDNA)；

b.使样品与至少一种与DNA缔合蛋白结合的试剂接触；

c.分离试剂和任何其结合的蛋白质和cfDNA；

d.对分离的cfDNA测序；和