[发明专利]核苷酸类似物及其在核酸测序和分析中的用途

权利要求书

1.一种核酸测序方法，其包括：

a)提供至少一种与引物杂交的核酸模板；

b)用聚合酶和下述中的任一种延伸与所述核酸模板杂交的引物：

i)荧光标记的核苷酸类似物，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有通过可切割的接头与碱基连接的标记和3'-羟基基团上的保护基团，其中不同的核苷酸可以具有不同的锚和不同的可切割的基团；

ii)锚标记的核苷酸类似物，其中所述锚标记的核苷酸类似物具有通过可切割的接头与碱基连接的锚和3'-羟基基团上的保护基团，其中不同的核苷酸可以具有不同的锚和不同的可切割的基团；或者

iii)荧光标记的核苷酸类似物和锚标记的核苷酸类似物二者的组合，其中所述荧光标记的核苷酸类似物或锚标记的核苷酸类似物具有通过可切割的接头与碱基连接的标记和3'-羟基基团上的保护基团，其中不同的核苷酸可以具有不同的可切割的基团；

c)任选地用3'被保护的且没有任何碱基修饰的核苷酸来延伸任何未延伸的引物，并鉴别由于掺入了荧光核苷酸类似物而产生的荧光信号；

d)任选地用荧光标记的锚结合分子来标记锚连接的引物延伸产物；

e)鉴别由于在步骤d中进行的标记而新产生的荧光信号以部分或完全地鉴别所掺入的核苷酸；

f)任选地重复步骤d和步骤e；

g)任选地用特异性可切割剂从荧光标记的核苷酸上切割标记，所述特异性可切割剂切割接头中的一种，但不切割正交接头；

h)鉴别由于在步骤f中进行的切割而导致的荧光丢失，以部分或完全地鉴别所掺入的核苷酸；

i)任选地重复步骤g和步骤h；

j)通过比较步骤c、步骤e和步骤h中获得的结果，确定掺入的特定核苷酸类似物；

k)从延伸的引物上切割任何剩余的标记或锚，同时恢复3'-羟基基团；和

l)重复执行步骤a至步骤k以获取所述核酸模板的序列，从而对核酸进行测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括1种标记、2种不同的标记、3种不同的标记或4种不同的标记。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述标记通过所述可切割的接头直接与所述碱基连接。

4.根据权利要求2和3所述的方法，其中标记包括染料簇。

5.根据权利要求2和3所述的方法，其中标记包括能量转移供体染料和受体染料。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其包括1种锚类型、2种不同的锚类型、3种不同的锚类型或4种不同的锚类型以及相等数量的标记的锚结合分子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述锚包含生物素、TCO、DBCO和四嗪，并且所述标记的锚结合分子分别包含链霉亲和素、四嗪、叠氮和TCO。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中将所述锚结合分子用荧光有机染料或量子点标记。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述荧光有机染料标记选自包括荧光素、若丹明、花青、ATTO或Dyomics染料的一组染料。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述锚包括锚簇。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中：

a)所述锚或锚簇包含供体染料或受体染料，

b)一个锚结合分子或多个锚结合分子包含对应于所述锚或锚簇上的供体/受体染料的供体染料或受体染料，和

c)所述锚或锚簇与所述一个锚结合分子或多个锚结合分子的连接导致能量从供体染料转移到受体染料，其中供体可以是量子点。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其包括1种可切割的接头类型、2种可切割的接头类型、3种可切割的接头类型或4种可切割的接头类型。