[发明专利]蛋白定量分析

权利要求书

1.一种用于检测和/或定量生物样品中的靶蛋白的方法，所述方法包括：

a）将包含靶蛋白的生物样品加入至固定化捕获实体，以捕获靶蛋白，从而形成固定化靶蛋白；

b）将包含有机溶剂的变性溶液加入至固定化靶蛋白，以形成变性的固定化靶蛋白；

c）将包含蛋白酶的消化溶液加入至变性的固定化靶蛋白，以形成包含蛋白水解肽的溶液；和

d）通过基于质谱法的技术来分析包含蛋白水解肽的溶液，以检测和/或定量生物样品中的靶蛋白，其中所述分析利用了在所述方法的一个步骤过程中添加的至少一种内部标准蛋白或肽。

2.权利要求1的方法，其中所述固定化捕获实体是抗体、抗体片段、蛋白、蛋白片段、配体或适体。

3.权利要求1或2的方法，其中所述固定化捕获实体通过直接键、接头或亲和相互作用连接至固体支持物。

4.权利要求3的方法，其中所述亲和相互作用包括链霉抗生物素蛋白-生物素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、适体或配体。

5.权利要求3或4的方法，其中所述固体支持物是孔板、微孔板、珠、树脂、芯片、纤维或反应管。

6.权利要求7至9中任一项的方法，其中所述固定化捕获实体是附着至链霉抗生物素蛋白包被的固体支持物的生物素化抗体。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述靶蛋白是抗体、抗体片段或包含抗体片段的融合蛋白。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述生物样品是血清或血浆。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中允许步骤（a）在室温下进行约1小时至约4小时。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中步骤（a）随后为至少一个洗涤步骤。

11.权利要求1至12中任一项的方法，其中在步骤（b）处的变性溶液中的有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、三氟乙醇、乙腈、甲酰胺、二甲基甲酰胺或其组合，并且以按体积计约30%至约100%存在。

12.权利要求11的方法，其中所述有机溶剂是甲醇或乙醇，并且以按体积计约40%至约60%存在。

13.权利要求1至12中任一项的方法，其中允许步骤（b）在室温下进行约5分钟至约60分钟。

14.权利要求1至13中任一项的方法，其中在步骤（c）处的消化溶液中的蛋白酶是胰蛋白酶。

15.权利要求14的方法，其中所述胰蛋白酶是哺乳动物胰蛋白酶。

16.权利要求1至15中任一项的方法，其中允许步骤（d）在约50℃至约70℃下进行约1小时至约4小时。

17.权利要求1至16中任一项的方法，其缺乏在步骤（b）和（c）之间的洗涤步骤和/或倾析步骤。

18.权利要求1至17中任一项的方法，其缺乏在步骤（c）之前的还原步骤和/或烷基化步骤。

19.权利要求1至18中任一项的方法，其中通过将包含有机溶剂的变性溶液和包含蛋白酶的消化溶液同时加入至所述固定化靶蛋白，来组合步骤（b）和（c）。

20.权利要求19的方法，其进一步包括在约50℃至约70℃下温育约1小时至约4小时。