[发明专利]生物传感器

说明书

本发明一般地涉及将CRISPR/CAS引导RNA(再‑)改造用于独立于蛋白的信号发生。

背景和概述

发明背景

A.发明领域

本发明一般地涉及将CRISPR/CAS引导RNA(再-)改造用于独立于蛋白的信号发生。在一个具体实施方案中，本发明涉及使CRISPR/Cas引导RNA包含有tracrRNA-NAzyme杂合体，更具体地改造的tracrRNA-NAzyme杂合体可以被改造以具有10-23个NAzyme基序或8-17个核心NAzyme基序用于催化活性。

B.相关技术描述

CRISPR/Cas是一种生物学复合物，包含核酸组分和蛋白组分。典型的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)SpCas9复合物包括引导RNA(由CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)部分组成)和相关蛋白Cas9(CRISPR相关蛋白9)。

CRISPR/Cas复合物特异地与靶标核酸结合，并且切割它。靶标核酸由引导RNA序列限定，并且切割位点取决于引导RNA和Cas两者，并且Cas负责切割靶标核酸。Cas的失活形式(dead version)dCas保留原始Cas的所有序列特异性和识别活性，而没有切割活性(参见图1)。

野生型crRNA-tracrRNA和单融合引导RNA(sgRNA)两者都已经成功地用于许多应用，范围从基因组编辑和DNA标记到诊断。在所有这些应用中，放大的信号由以下产生：Cas蛋白的切割活性，与另一蛋白缀合的dCas蛋白的结合，或外部信号传导分子从CRISPR/Cas复合物分离。利用引导RNA用于信号发生的策略是非催化性的并且不放大信号。

在本发明中，另一方面，CRISPR系统(例如CRISPR/Cas复合物)的引导RNA组分通过在tracrRNA序列中引入NAzyme进行改造，产生杂合RNA-DNA分子。在CRISPR/Cas复合物中，杂合引导RNA成功地与Cas9和dCas9形成功能复合物，并且具有杂合体的复合物成功地结合并切割靶DNA。以这种方式，包含具有NAzyme序列(其包含在tracrRNA序列中)的引导RNA的改造的CRISPR/Cas复合物可以与天然CRISPR/Cas活性联合用于放大的信号发生。

发明概述

通过将DNAzyme序列改造到CRISPR/Cas系统的引导RNA中，本发明解决了相关技术问题。出人意料地发现，杂合体DNA-RNA形式仍然与CRISPR/Cas系统的功能相容，而NAzyme活性在复合物形成后仍然是完好的。尽管NAzyme本身也具有核酸切割活性，并且任何交叉反应性将损害系统的功效，但是显示了杂合体RNA没有干扰Cas9的切割。

根据本发明的目的，如本文体现和广泛描述，本发明广义上涉及生物传感器系统，其适用于所有CRISPR/Cas系统，与哪个Cas蛋白无关。

在本发明的一方面，涉及一种产生基于CRISPR/Cas复合物的传感器的方法，该方法包括改造CRISPR的引导RNA组分的tracrRNA中的化学反应性核酸(NAzyme)。

本发明的另一方面是包含tracrRNA-NAzyme杂合体的改造的CRISPR。

本发明还有另一方面是传感器试剂盒，特征在于所述传感器试剂盒包含在具有Cas-crRNA、具有Cas9-crRNA、具有dCas-crRNA或具有dCas9-crRNA的复合物中的杂合体tracrRNA-NAzyme，并且另外包含NAzyme所针对的标记的寡核苷酸底物，优选NAzyme的荧光团标记的寡核苷酸底物。