[发明专利]具有减少的翻译后修饰的肽接头

说明书

本文报道了一种融合多肽，其包含氨基酸序列GnSGmX1X2X3(SEQ ID NO:02)，其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，其中n＝1、2、3或4，其中m＝3、4或5。

本发明属于重组多肽生产领域。本文详细报道了一种新的肽接头，其可减少翻译后修饰，从而产生较少的产物异质性，特别是在融合多肽的重组生产中。

背景技术

在真核细胞中引入重组产生的多特异性抗体使得产生许多不同分子形式。在其中一些分子形式中，使用了域结构，其中使用接头将不同的非自然关联结构域彼此融合。如果旨在重组生产融合多肽，则这种接头必须为可编码的接头，例如肽接头。

肽接头是用于连接不同多肽结构域的合成氨基酸序列。肽接头通常由氨基酸的线性链组成，其中20种天然存在的氨基酸是通过肽键连接的单体结构嵌段。肽接头可以具有1至50个氨基酸残基的长度，在大多数情况下选择3至25个氨基酸残基的长度。肽接头可以包含重复的氨基酸序列。肽接头具有可确保组件由接头连接的功能，可以通过使结构域正确折叠并正确呈现来实现其生物学活性。通常，肽接头是合成肽接头，其被指定为富含甘氨酸残基、谷氨酰胺残基和/或丝氨酸残基。这些残基以最多五个氨基酸的小型重复单元排列，诸如GGGS或GGGGS(分别为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)。小型重复单元可以重复两次至五次以形成多聚体单元，例如(GGGS)₂或(GGGGS)₂。

遗憾的是，在真核宿主细胞中重组生产包含肽接头的融合多肽时，肽接头内的氨基酸残基可以充当体内翻译后修饰的底物。翻译后修饰的添加导致重组产生的融合多肽的异质性增加。因此，可减少或甚至消除翻译后修饰的添加的新肽接头将能够重组生产更同质的融合多肽制剂。

在Spahr等人(MAbs 9(2017)812-819)的发表文献中，报道了GGGGP(SEQ ID NO:18)接头中的羟脯氨酸。

Shi,Y.报道了有关生物化学和结构研究的信息，这些研究促进了对三大类蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶机理的理解，重点在于PP2A(Cell 139(2009)468-484)。

Baslé,E.等人报道了关于内源性氨基酸的蛋白质化学修饰的信息(Chem.Biol.17(2010)213-227)。

在WO 2003/062276中公开了多肽变体，其包含经由柔性多肽接头分子连接的细胞因子的配体结合结构域。

WO 2011/161260公开了抗癌融合蛋白。

WO 2012/088461公开了缺少氨基酸序列GSG的接头肽减少或消除向包含该接头肽的多肽添加翻译后修饰。

WO 2014/085621公开了可用于治疗溶酶体贮积病的治疗性融合蛋白及用于治疗此类疾病的方法。

WO 2015/091130公开了一种用于重组生产可溶形式多肽的方法，该方法包括以下步骤：用编码该多肽的核酸转染真核细胞，由此，该多肽已通过引入一个或多个人工糖基化位点而被修饰(与野生型多肽相比)；在培养基中培养转染的细胞；以及从培养基中回收多肽，由此，与野生型多肽相比，单体多肽的产量(在一个纯化步骤后测定)提高了至少100％。

WO 2016/115511公开了VEGF变体多肽组分。

WO 2011/161260公开了一种融合蛋白，其包含：结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段；和结构域(b)，其为促细胞凋亡效应肽的序列。

WO 2016/120216公开了一种编码包含至少一个细胞外结合结构域的嵌合抗原受体的多肽，该至少一个细胞外结合结构域至少包含由对抗原具有特异性的VH链和VL链形成的scFv，其中所述细胞外结合结构域包含至少一个mAb特异性表位。