[发明专利]原位基因测序方法

权利要求书

1.一种用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的方法，所述方法包含：

(a)在允许发生特异性杂交的条件下，使固定透化完整组织与至少一对寡核苷酸引物接触，

其中所述引物对包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸；

其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含第一互补性区域、第二互补性区域和第三互补性区域；其中所述第二寡核苷酸进一步包含条形码序列；

其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述靶核酸的第一部分互补，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域与所述第二寡核苷酸的第一互补性区域互补，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域与所述第二寡核苷酸的第三互补性区域互补，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域与所述靶核酸的第二部分互补，而且其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述第二寡核苷酸的第二互补性区域相邻；

(b)加入连接酶以连接所述第二寡核苷酸，并生成封闭的核酸环；

(c)在核酸分子存在的情况下进行滚环扩增，其中所述操作包含采用所述第二寡核苷酸作为模板，以及采用所述第一寡核苷酸作为促使聚合酶形成一个或更多个扩增子的引物；

(d)在水凝胶亚单元存在的情况下包埋所述一个或更多个扩增子，以形成一个或更多个水凝胶包埋的扩增子；

(e)在允许连接的条件下，使具有条形码序列的所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子与一对引物接触，其中所述引物对包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，其中仅在第三寡核苷酸和第四寡核苷酸与同一扩增子连接时，方实现连接；

(f)重复步骤(e)；以及

(g)对所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子进行成像，以确定完整组织内细胞中靶核酸的原位基因测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物对在接触所述样品之前加热变性。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞存在于细胞群中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞群包含多种细胞类型。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中接触所述固定透化完整组织包含使所述引物对与同一靶核酸杂交。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RNA是mRNA。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含挂锁探针。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域的长度为19-25个核甘酸。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域的长度为6个核甘酸。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域的长度为6个核甘酸。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第一互补性区域的长度为6个核甘酸。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域的长度为19-25个核甘酸。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第三互补性区域的长度为6个核甘酸。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第一互补性区域包含所述第二寡核苷酸的5'末端。