[发明专利]用于测量AADC病毒载体效力的方法

权利要求书

1.用于测量AADC病毒载体效力的方法，包括：

(a)提供包含AADC病毒载体的AAV制剂，其中所述AADC病毒载体是包含编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸的AAV载体；

(b)在产生从所述AADC多核苷酸产生AADC多肽的细胞的条件下使所述AAV制剂与所述细胞接触；

(c)裂解所述细胞以形成包含所述AADC多肽的至少部分的细胞裂解物；

(d)如下确定所述AADC病毒载体的效力：

(i)在允许所述细胞裂解物中的所述AADC多肽的至少部分与L-3,4二羟基苯丙氨酸(“L-DOPA”)的至少部分起反应以产生多巴胺的条件下，向所述细胞裂解物中添加所述L-DOPA；

(ii)在所述AADC多肽和所述L-DOPA之间的反应后测量所述细胞裂解物中的多巴胺的量；和

(iii)提供用于多巴胺产生的AADC病毒载体效力参考标准品；

(iv)与所述AADC病毒载体效力参考标准品比较使用所述AADC病毒载体产生的多巴胺的量，从而测量所述AADC病毒载体的效力。

2.权利要求1所述的方法，其中如下确定由所述AADC病毒载体参考标准品产生的多巴胺的量：

(a)将L-DOPA添加到包含AADC的细胞裂解物中，其中所述细胞裂解物中的所述AADC由用包含编码AADC的多核苷酸的AADC病毒载体参考标准品转导的细胞产生；和

(b)测量所述AADC和所述L-DOPA之间反应后所述细胞裂解物中产生的多巴胺的量。

3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞为HT1080细胞。

4.权利要求3所述的方法，其中所述HT1080细胞以7x10³至4x10⁴个细胞/孔之间的密度铺板。

5.权利要求3所述的方法，其中所述HT1080细胞以9x10³至2x10⁴个细胞/孔之间的密度铺板。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在转导后18-30小时后收获所述细胞。

7.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在转导后22-26小时后收获所述细胞。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述AADC病毒载体以约1个载体基因组(vg)/细胞至约1×10⁸vg/细胞的浓度转导至所述细胞中。

9.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述AADC病毒载体以约10vg/细胞至约1×10⁵vg/细胞的浓度转导至所述细胞中。

10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使用化学裂解、机械裂解或其组合裂解所述细胞。

11.权利要求10所述的方法，其中使用化学裂解来裂解所述细胞，并且其中所述化学裂解包含裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含蛋白酶抑制剂、磷酸盐缓冲液盐水和TritonX100。

12.权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述裂解过程包括在室温下以3650-3800RPM在离心机中旋转所述细胞5-20分钟。

13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中将AADC反应缓冲液与所述L-DOPA一起添加至所述细胞裂解物中，并且其中所述AADC反应缓冲液包含辛磺酸钠盐、磷酸二氢钠和乙腈。

14.权利要求13所述的方法，其中所述AADC反应缓冲液包含3.0-3.5mM的辛磺酸钠盐，pH 3.0、72.5mM的磷酸二氢钠(NaH2PO4)和10％的乙腈。