[发明专利]利用源自芽孢杆菌菌株的聚γ-谷氨酸合成基因的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面表达蛋白的方法

说明书

本发明涉及具有用于编码聚γ‑谷氨酸合成酶的pgsA基因的表面表达载体、以及通过使用该载体在微生物表面表达靶蛋白的方法。将其中添加有外源基因的载体转化微生物，并允许外源蛋白在微生物表面稳定表达。

技术领域

本发明涉及利用外膜蛋白(pgsA)在微生物表面表达外源蛋白的新载体，所述外膜蛋白(pgsA)源自Bacillus sp.菌株并参与聚γ-谷氨酸的合成。此外，本发明涉及通过利用外膜蛋白在微生物表面上表达外源蛋白来生产蛋白的方法，所述外膜蛋白源自Bacillussp.菌株并参与聚γ-谷氨酸的合成。

背景技术

细胞表面展示是指将蛋白质或肽与适当的锚定基序(anchoring motif)融合并在革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌、真菌、酵母或动物细胞的表面上表达的技术(Lee S.Y.等，Trends Biotechnol.，21:4552，2003)。根据1980年代开发的第一种细胞表面展示技术，使用具有相对简单表面的噬菌体，将肽或小蛋白与丝状噬菌体的pIII融合，并在噬菌体表面上表达。因此，细胞表面展示技术被称为表面表达系统。将使用噬菌体的细胞表面展示用于抗体的抗体筛选或者表位、高亲和力配体等的筛选，但是局限在于可在噬菌体表面上表达的蛋白质的大小相对有限。因此，作为其替代，已经开发出使用细菌的细胞表面表达。这是利用微生物(例如细菌或真菌)的表面蛋白作为表面锚定基序在微生物表面稳定表达外源蛋白的领域。

为了利用特定有机体的外膜蛋白在细胞表面表达外源蛋白，应通过将合适的表面蛋白和外源蛋白在基因水平上彼此连接来生物合成融合蛋白，并且它们应稳定地穿过内膜，并应保持锚定在细胞表面上。为此，优选使用具有以下性质的蛋白质作为表面锚定基序：首先，该蛋白质应在其N端具有能够穿过内膜的分泌信号；第二，该蛋白质应具有可稳定地锚定至外膜表面的靶向信号；第三，该蛋白质应在不对细胞生长产生不利影响的范围内在细胞表面上大量表达，以便使该蛋白质能够表现出高活性；最后，该蛋白质无论其大小都应稳定表达，以便使其可用于各种反应(Georgiou等，TIBTECH，11:6，1993)。该表面锚定基序需要进行基因工程化，以将其插入宿主细胞表面上的外膜蛋白的N端或C端或者以将其插入该蛋白的中心(Lee等，TIBTECH，21:45，2003)。

为了使蛋白质在细菌表面上表达，能够使在细胞中生物合成的蛋白质穿过细胞膜的分泌信号应位于蛋白质的一级序列上。另外，在革兰氏阴性细菌的情况下，蛋白质应穿过内膜和周质空间，并应被插入和锚定至外膜，以便从膜上突出。

在细菌的情况下，具有这种分泌信号以及可稳定地锚定至细胞表面的靶向信号的蛋白质的实例包括表面蛋白、特殊的酶、毒素蛋白等。事实上，如果将这些蛋白质的分泌信号和靶向信号与适当的启动子一起使用，则可在细菌表面成功表达蛋白质。

用于外源蛋白的表面表达的细菌表面蛋白可大致分为四种类型：细胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白和细胞表面蛋白。至今，已尝试使用主要存在于革兰氏阴性细菌中的表面蛋白(例如LamB、PhoE、OmpA等)在细菌表面表达必需的外源蛋白。当使用这些蛋白质时，将外源蛋白插入到细胞表面上的突出环(protruding loop)中，因此从结构上来讲可插入的蛋白质的大小受到限制。另外，由于待插入的外源蛋白的C端和N端应在空间上彼此靠近，因此存在当C端和N端之间的距离远时要通过接头肽使两个末端彼此靠近的问题。

事实上，当利用LamB或PhoE来插入由50个-60个以上氨基酸或更多个氨基酸组成的外源多肽时，由于结构限制导致未形成稳定的膜蛋白[Charbit等，J.Immunol.，139：1658-1664(1987)；Agterberg等，Vaccine，8：85-91(1990)]。尽管也存在利用OmpA将外源蛋白插入突出环中的情况，但是为了克服结构限制，仅使用含有能够锚定至外膜的最小靶向信号的OmpA片段。作为该方法，存在将β-内酰胺酶与OmpA靶向信号的C端连接并在细胞表面表达的情况。