[发明专利]用于测序数据的归一化和定量的方法

说明书

用于测序数据的归一化和定量的方法和试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月20日提交的美国临时专利申请号62/660,460的利益和优先权，所述美国临时专利申请的全部内容引入本文作为参考。

背景

读取包含多核苷酸的碱基序列的能力已对生物学研究具有并不夸张的影响。对于过去40年中的大多数时间，双脱氧DNA‘桑格（Sanger）’测序已在许多实验室中用作标准测序技术，并且它的顶峰是人基因组序列的完成。然而，由于桑格测序是对单个扩增子执行的，因此桑格测序的流通量是有限的，并且大规模桑格测序项目是昂贵且费力的。

DNA测序的范例随着‘下一代’测序（NGS）技术的出现而改变，所述NGS技术平行加工数十万至数百万个DNA片段，导致生成序列每碱基的低成本、以及在单个测序运行中在千兆碱基（Gb）到兆兆碱基（terabase）（Tb）规模上的流通量。值得注意的是关于以下事实的思考：著名地于2001年在Science and Nature中共同公布的首个人基因组，需要15年来测序且花费近30亿美元。相比之下，现代的NGS测序仪可以在一天内对45个人基因组进行测序，每个基因组大约$1000。因此，NGS现在可以用于定义整个基因组的特征并且描绘它们之间的差异，允许研究人员获得遗传变异的全谱的更深入了解，并且定义其在表型变异和复杂性状的发病机理中的作用。

然而，NGS对临床和诊断应用的应用可能受实验室内和实验室间高变化限制。这些问题降低了任何结果的价值，并且已阻止了这些测序方法在分子诊断中的用途。例如，NGS文库制备和测序反应制备的复杂性和可变性可以导致样品间差异和实验室间差异，其可以使得难以确定例如在样品中检测到的遗传变异或病原性生物的普遍性。

在另一种情况下，诊断测定（例如FilmArray实验对象组，BioFire，SLC，UT）中靶向的许多病原体，可以在环境中和作为在样品收集的部位处的共栖菌丛（commensals）而发现。例如，在疾病例如肺炎中，最频繁遇到的细菌病原体也可能作为口咽通道的“正常菌群”存在，所述口咽通道本身经常是样品采集的部位（痰和气管抽吸物或鼻咽拭子（NPS））、或用于收集更具侵入性的样本例如支气管肺泡灌洗物（BAL）的路径。在此类情况下，被正常菌群的频繁污染或正常菌群的共同收集基本上是不可避免的。在此类情形下，NGS的诊断能力可能受以下事实限制：由于NGS可以检测到高浓度和最低限度浓度的生物的存在（即，NGS具有几乎无限的动态范围）的可能性，而没有提供大量的内在背景来解释测序数据中检测的临床相关性（例如，NGS可以检测病原体（即，来自病原体的核酸）的存在及其与其它检测到的核酸或生物的相对丰度（%），而没有提供检测到的病原体是否以临床相关浓度存在的任何指示），临床相关的生物无法容易地与共栖菌丛或污染区别开。