[发明专利]色谱珠、其生产及用途

说明书

本发明涉及色谱珠、其生产和用途。更接近地，本发明涉及小的、刚性的和不可渗透的琼脂糖珠，其适合于例如在高效液相色谱(HPLC)中作为固定相，用于分析生物分子，例如肽和蛋白质；和生产所述珠的方法。

技术领域

本发明涉及色谱珠、其生产和用途。更接近地，本发明涉及小的、刚性的和不可渗透的琼脂糖珠，其主要适合于例如在高效液相色谱(HPLC)中作为固定相，用于分析生物分子，例如肽和蛋白质；和生产所述珠的方法。

背景技术

HPLC(高效液相色谱)是一种液相色谱方法，其对于化学和生化化合物的研究、制造和诊断至关重要。通常由于获得的速度和分辨率，常常在高压色谱系统中对生物分子(例如肽、蛋白质及其潜在的变体)进行表征和分析。两种类型的柱主要用于常规分析。它们是填充柱或整体柱。填充柱包含最常呈球形珠形状的颗粒固定相，所述球形珠彼此紧密堆积，且柱床高度范围为3-30 cm。由于其刚性，用于HPLC柱的市售固定相通常基于二氧化硅或合成有机树脂例如聚苯乙烯。在较短的柱中使用较小直径的珠是一种非常有效的方式，以便以快速率实现高效能分离，但同时也意味着相当高的背压。因此，仅使用非常刚性的固定相材料。最常用的技术是反相色谱。

填充柱目前可用的HPLC固定相是基于1.7-10µm的珠状二氧化硅或合成聚合物，其中小直径的珠使得色谱效率提高。

分析性蛋白质分离的主要挑战是获得具有高分辨率和低非特异性吸附的快速分离。填充柱中的珠是多孔的或无孔的，具有各自的优点和缺点。二氧化硅和合成的无孔颗粒具有扩散路径短，仅在珠表面上结合的优势，这意味着更快的质量转移。多孔珠提供更大的表面积，这意味着更多的与分析物相互作用的位点和更高的结合能力。

已经描述了用于HPLC的其它类型的固定相。在US 5135650中，Hjertén等人描述了通过收缩珠或填充孔将多孔琼脂糖珠转化成基本上不渗透蛋白质的珠的方法。通过用不同的有机溶剂(例如二噁烷和氯仿)进行顺序处理并结合交联，进行Hjertén方法的收缩。填充是通过添加可聚合物质例如缩水甘油进行的，所述可聚合物质允许部分结合到内部孔以及珠表面。最终的珠被描述为具有足够降低的孔隙率，以防止分子量为3 kDa或更高的蛋白质渗透，并且填充有这些珠的柱已显示最高可承受40巴的压力。收缩方法的主要缺点是使用溶剂，例如二噁烷，其由于环境、健康和安全原因通常避免使用。

发明内容

本发明提供小的、刚性的和不可渗透的琼脂糖珠，其适合于在高效液相色谱(HPLC)中作为固定相，用于分析生物分子，例如肽和蛋白质；并且还用于在更大规模中的制备性用途。

本发明提供固体琼脂糖珠，并具有刚性以排除小至100g/mol的化合物，即基本上排除甚至最简单的二肽。

在第一方面，本发明涉及固体琼脂糖珠，其中所述琼脂糖珠是刚性的，并且对于分子量低至3000g/mol，优选100g/mol的化合物是不可渗透的。

优选地，所述珠具有1-25μm的直径，对于HPLC而言优选1-15μm，对于制备性应用而言优选15-25μm。

根据本发明的固体琼脂糖珠承受超过100巴的压力，优选≥300巴的压力，用于高压下的快速分析性应用和低压下的更大规模的制备性应用。小珠-高压。大珠-低压。

优选地，固体琼脂糖珠提供有触角/接枝聚合物，以增加表面积并实现功能化。

触角或珠表面可提供有配体，例如阳离子配体、阴离子配体、亲和(蛋白A、IMAC)配体、疏水相互作用配体或其组合。

在本发明的一个实施方案中，固体琼脂糖珠的直径为1-15μm，并装填在HPLC柱中。一个或多个HPLC柱可以连接至HPLC系统。当提供多于一个柱时，柱的珠优选具有不同的功能性(连接不同的配体)。