[发明专利]RNA-指导的核酸酶及其活性片段和变体及其使用方法

权利要求书

1.一种核酸分子，其包含编码RNA-指导的核酸酶(RGN)多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码RGN多肽的核苷酸序列，所述RGN多肽包含与SEQ ID NO：1、11、19、27、36、45或54具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

其中当所述RGN多肽与能够与靶DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时，所述RGN多肽以RNA-指导的序列特异性方式结合所述靶DNA序列，和

其中所述编码RGN多肽的多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。

2.权利要求1所述的核酸分子，其中所述RGN多肽是核酸酶失活的或起切口酶的作用。

3.权利要求2所述的核酸分子，其中所述RGN多肽可操作地融合至碱基编辑多肽。

4.一种载体，其包含权利要求1-3中任一项所述的核酸分子。

5.权利要求4所述的载体，其中所述载体还包含至少一个编码所述指导RNA的核苷酸序列，并且其中所述指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO：2、12、20、28、37、46或55具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

6.权利要求4或5所述的载体，其中所述指导RNA包含与SEQ ID NO：3、13、21、29、38、47或56具有至少95％序列同一性的tracrRNA。

7.一种细胞，其包含权利要求1-3中任一项所述的核酸分子或权利要求4-6中任一项所述的载体。

8.一种用于结合靶DNA序列的系统，所述系统包含：

a)能够与所述靶DNA序列杂交的一种或多种指导RNA或编码所述一种或多种指导RNA(gRNA)的一种或多种核苷酸序列；和

b)包含与SEQ ID NO：1、11、19、27、36、45或54具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的RNA-指导的核酸酶(RGN)多肽或编码所述RGN多肽的核苷酸序列；

其中编码所述一种或多种指导RNA的所述核苷酸序列和编码所述RGN多肽的所述核苷酸序列各自可操作地连接至与每个所述核苷酸序列异源的启动子；

其中所述一种或多种指导RNA与所述靶DNA序列杂交，和

其中所述一种或多种指导RNA与所述RGN多肽形成复合物，从而引导所述RGN多肽与所述靶DNA序列结合。

9.权利要求8所述的系统，其中所述靶DNA序列在真核细胞内。

10.权利要求8或9所述的系统，其中所述RGN多肽是核酸酶失活的或起切口酶的作用，并且其中所述RGN多肽可操作地连接至碱基编辑多肽。

11.权利要求8-10中任一项所述的系统，其中所述系统进一步包含一种或多种供体多核苷酸或编码所述一种或多种供体多核苷酸的一种或多种核苷酸序列，其中编码所述一种或多种供体多核苷酸的所述核苷酸序列各自可操作地连接至与每个所述核苷酸序列异源的启动子。

12.一种用于结合靶DNA序列的方法，所述方法包括将根据权利要求8-11中任一项所述的系统递送至所述靶DNA序列或包含所述靶DNA序列的细胞。

13.一种用于切割和/或修饰靶DNA序列的方法，所述方法包括使所述靶DNA序列与以下接触：

a)RNA-指导的核酸酶(RGN)多肽，其中所述RGN包含与SEQ ID NO：1、11、19、27、36、45或54具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

b)一种或多种指导RNA，其能够将(a)的RGN靶向至所述靶DNA序列；

其中所述一种或多种指导RNA与所述靶DNA序列杂交，从而引导所述RGN多肽与所述靶DNA序列结合并发生所述靶DNA序列的切割和/或修饰。