[发明专利]用于核苷酸链的纳米结构测序的微流体装置和方法

说明书

本发明涉及用于对核苷酸链进行测序的微流体装置（100）和方法（600），所述微流体装置包括阵列装置（200）和与所述阵列装置（200）连接的纳米结构（300），其中所述阵列装置（200）包括具有用于聚合酶链反应的物质（11、12、13）的阵列单元（221、222、223、224），其中所述阵列单元（221、222、223、224）包含根据桑格测序方法具有终止特性的核苷酸（13）和用于不对称聚合酶链反应的引物（11、12），并且其中纳米结构（300）被设计为确定由聚合酶链反应形成的核苷酸链的长度。

背景技术

从现有技术中已知用于确定DNA分子中的核苷酸序列的多种DNA测序方法，特别是根据桑格的双脱氧法，其也称为链终止合成且以下称为桑格测序方法。

在该方法中，在四个在其它方面相同的聚合酶链反应（PCR）批次中，添加部分作为双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）的四个碱基中的各一个（即各一个批次具有ddATP、ddCTP、ddGTP或者ddTTP）。这些链终止-ddNTP不具有3'-羟基。如果它们并入新合成的链中，则通过DNA聚合酶的DNA延长不再是可行的，并且产生不同长度的DNA片段，这些片段在每个单独批次中始终以相同的ddNTP为末端（即各批次仅具有A或C或G或T）。可以用探针对这些ddNTP进行放射性标记，以使得可以通过凝胶电泳确定这些DNA片段的长度并通过长度比较来确定核苷酸序列。或者，可以经由“飞行时间”测量通过将所有PCR产物引导通过由纳米孔对界定的通道来进行测序，如例如WO16154337A2中所述。

此外，从现有技术中已知定量PCR（qPCR），其中特别地借助荧光测量可以实时定量地追踪DNA片段的复制。

发明公开

发明优点

在这种背景下，本发明涉及微流体装置，特别是阵列芯片，其组合了聚合酶链反应（PCR）和核苷酸链，特别是DNA片段的测序。该微流体装置可以在此特别是微流体环境的可集成部分，例如是用于集成到芯片实验室环境中，例如微流体筒中的阵列芯片。

该微流体装置包括阵列装置和与该阵列装置连接的纳米结构，其中该阵列装置包括具有用于进行PCR的物质的阵列单元。特别地，可以设置用于进行定量PCR的阵列单元。该阵列单元包含根据桑格测序方法具有终止特性的核苷酸以及用于不对称聚合酶链反应的引物。微流体装置的纳米结构被设计为确定由聚合酶链反应形成的核苷酸链的长度。一些或全部引物可包含用于光学监测PCR的荧光标记。

核苷酸链特别可以是例如由样品准备和样品纯化（例如与预扩增，特别是嵌套式PCR（“巢式PCR”）或基因组扩增（“全基因组扩增”，WGA）组合）获得的DNA部分或DNA片段。在此，这些片段可以例如在阵列装置中以与聚合酶、标准核苷酸（A、T、C、G）和所需盐缓冲物的PCR混合物混合的方式提供。阵列装置可以特别地包含基底，其中该基底具有呈凹槽或凹陷形式的阵列单元，可以在其中进行PCR。该基底可以是微流体技术中常用的基底，其特别是由塑料制成。

不对称聚合酶链反应被理解为特别是这样的PCR，其中与经典PCR相反，在PCR结束后特别是基于数量级而言不产生相同数量的被复制的正向链和反向链。相反，在不对称PCR中，与反向链相比，特别是基于数量级而言产生特别是不同大数量的正向链，反之亦然。特别地，不对称PCR具有指数进程和随后的线性进程，其中在指数进程中，正向链和反向链基本上以相同数量复制，并且在线性进程中，仅正向链或反向链复制。

根据桑格测序方法具有终止特性的核苷酸（终止核苷酸）被理解为特别是双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP），以使得除脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）以外，可以向各一个PCR批次添加四个ddNTP之一以进行桑格测序方法。

纳米结构尤其可被理解为具有在纳米尺寸范围内的结构单元的结构。特别地，纳米结构可以具有尺寸在纳米范围内的孔和/或通道，其以下称为纳米孔和纳米通道。