[发明专利]用于准确且经济高效的测序、单体型分型和组装的基于单管珠粒的DNA共条形码化

权利要求书

1.一种无需使用纳米滴(nanodrops)而能制备用于靶核酸测序的测序文库的方法，该方法包括：

(a)将插入序列转座到所述靶核酸的第一片段中，其中所述插入序列包含杂交序列，并且其中所述转座在所述第一片段中产生切口；

(b)将(i)来自(a)的所述靶核酸的所述第一片段、(ii)夹板寡核苷酸和(iii)珠粒群体合并成单个混合物，其中每个珠粒包含固定在其上的捕获寡核苷酸，所述捕获寡核苷酸包括

1)包含标签(或条形码)的序列，其中每个包含标签(或条形码)的序列包含条形码序列，所述条形码序列可选地是三重条形码序列，其中固定在相同单个珠粒上的所述寡核苷酸包含相同的包含标签(或条形码)的序列，而大多数珠粒具有不同的包含标签(或条形码)的序列，

2)与夹板寡核苷酸的至少一部分互补的共同序列，其中所述夹板寡核苷酸的另一部分与所述杂交序列的至少一部分互补；

3)可选地，第一PCR引物退火位点；

(c)将单个珠粒的捕获寡核苷酸连接到单个第一片段的插入的杂交序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸包含所述第一PCR引物退火位点，还包括使3'分支连接衔接子寡核苷酸在所述切口处连接至所述第一片段，其中衔接子寡核苷酸的连接是3'分支连接，以及其中所述衔接子寡核苷酸包含第二PCR引物退火位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述3'分支连接衔接子寡核苷酸是平末端衔接子，并且所述3'分支连接包括将来自所述平末端衔接子的5'磷酸在所述第一片段的所述切口处共价连接至凹陷的3'羟基。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述第一PCR引物退火位点和所述第二PCR引物退火位点具有不同的序列。

5.根据权利要求1-4所述的方法，其中所述3’分支连接衔接子寡核苷酸包含条形码序列，其任选地是样本条形码序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在将所述插入序列转座到所述第一片段中的步骤中，所述转座酶保持与所述第一片段结合。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，包括从所述第一片段中去除所述转座酶，从而产生亚片段。

8.根据权利要求7所述的方法，包括扩增所述亚片段以产生扩增子。

9.根据权利要求8所述的方法，包括对所述扩增子测序以产生序列读段，其中具有相同条形码序列的序列读段来自相同的第一片段。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA，任选地是人基因组DNA。

11.根据权利要求1所述的方法，其中将两个不同的转座子插入所述第一片段。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA，任选地来自真核生物，任选地来自哺乳动物。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因组DNA来自单个个体生物，例如单个人类受试者。

14.根据权利要求1至10所述的方法，其中所述靶核酸来自原核生物或原核生物的异质群体，例如来自个体的微生物组。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前不扩增所述靶核酸。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述珠粒包含至少100000个拷贝的所述捕获寡核苷酸，或包含至少400000个拷贝的所述捕获寡核苷酸。