[发明专利]适合于从RNA进行核酸扩增的DNA聚合酶突变体

权利要求书

1.一种具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1-A12组成的序列的DNA聚合酶的突变体：

A1为支链氨基酸残基，

A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，

A3为亲水性中性氨基酸残基，

A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A5为支链氨基酸残基，

A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A7为支链氨基酸残基，

A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，

A11为酸性氨基酸残基，和

A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；

其中A3和/或A10被不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基替代。

2.权利要求1的突变体，其中所述在引入突变之前的由12个氨基酸组成的序列包含亮氨酸作为A1、谷氨酰胺作为A3、亮氨酸作为A5、异亮氨酸作为A7、谷氨酸作为A11和丙氨酸作为A12。

3.权利要求1或2的突变体，其中所述由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。

4.权利要求1-3中任何一项的突变体，其为来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶、来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶、来自热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)的DNA聚合酶、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶或来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶的突变体。

5.一种含有权利要求1-4中任何一项的突变体的试剂盒。

6.一种包含权利要求1-4中任何一项的突变体的组合物。

7.一种用于产生适合于从RNA进行核酸扩增的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的方法，所述方法包括：

(1) 选择包含由12个氨基酸A1-A12组成的序列的DNA聚合酶的步骤：

A1为支链氨基酸残基，

A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，

A3为亲水性中性氨基酸残基，

A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A5为支链氨基酸残基，

A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A7为支链氨基酸残基，

A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，

A11为酸性氨基酸残基，和

A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；和

(2) 用不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基替代步骤(1)中选择的DNA聚合酶的由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10的步骤。

8.权利要求7的方法，其中步骤(1)中选择的所述DNA聚合酶包含由12个氨基酸组成的序列，其中A1为亮氨酸，A3为谷氨酰胺，A5为亮氨酸，A7为异亮氨酸，A11为谷氨酸和A12为丙氨酸。

9.权利要求7 或8的方法，其中在步骤(2)中，A3和/或A10被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。

10.一种用于改善具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1-A12组成的序列的DNA聚合酶的方法：

A1为支链氨基酸残基，

A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，

A3为亲水性中性氨基酸残基，

A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A5为支链氨基酸残基，

A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A7为支链氨基酸残基，

A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，

A11为酸性氨基酸残基，和

A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；

所述方法包括用另一个碱性氨基酸残基替代A3和/或A10。