[发明专利]基于人APOBEC3A脱氨酶的碱基编辑器及其用途

权利要求书

1.一种产生经遗传修饰的植物的方法，包括将用于对植物细胞基因组中的靶序列进行碱基编辑的系统导入植物，所述系统包含以下i)至v)中至少一项：

i)碱基编辑融合蛋白，和向导RNA；

ii)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；

iii)碱基编辑融合蛋白，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

v)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

其中所述碱基编辑融合蛋白包含核酸酶失活的CRISPR效应蛋白和APOBEC3A脱氨酶，所述向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向植物细胞基因组中的靶序列，从而所述碱基编辑融合蛋白导致所述靶序列中的一或多个C被T取代，

其中所述核酸酶失活的CRISPR效应蛋白是核酸酶失活的Cas9或核酸酶失活的LbCpf1，所述核酸酶失活的Cas9由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的方法，其中所述APOBEC3A脱氨酶由相对于SEQ ID NO:2包含N57G取代的氨基酸序列组成。

3.权利要求1的方法，其中所述APOBEC3A脱氨酶被融合至所述核酸酶失活的CRISPR效应蛋白的N末端。

4.权利要求1的方法，其中所述APOBEC3A脱氨酶和所述核酸酶失活的CRISPR效应蛋白通过接头融合。

5.权利要求1的方法，其中所述碱基编辑融合蛋白还在其N端和/或C端包含核定位序列(NLS)。

6.权利要求1的方法，其中所述碱基编辑融合蛋白还包含UGI序列。

7.权利要求6的方法，其中所述UGI氨基酸序列示于SEQ ID NO:5。

8.权利要求1的方法，其中所述碱基编辑融合蛋白还包含Gam蛋白序列。

9.权利要求8的方法，其中所述Gam蛋白氨基酸序列示于SEQ ID NO:6。

10.权利要求1的方法，其中所述碱基编辑融合蛋白由SEQ ID NO:7-11之一所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:12-16之一所示的氨基酸序列组成。

11.权利要求1的方法，其中所述编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列针对待进行碱基编辑的植物进行密码子优化。

12.权利要求11的方法，其中所述编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列示于SEQ IDNO:7-9中任一个。

13.权利要求1的方法，其中所述向导RNA是单向导RNA(sgRNA)。

14.权利要求1的方法，所述编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和/或所述编码向导RNA的核苷酸序列与植物表达调控元件可操作地连接。

15.权利要求14的方法，其中所述调控元件是启动子。

16.权利要求15的方法，其中所述启动子是35S启动子、玉米Ubi-1启动子、小麦U6启动子、水稻U3启动子或玉米U3启动子。

17.权利要求1的方法，其中所述向导RNA的靶区域长度为20个核苷酸。

18.权利要求1的方法，其中所述导入在不存在选择压力下进行。