[发明专利]用于检测生物膜的试剂盒和用于检测生物膜的方法

说明书

本发明涉及用于在受试组织中检测生物膜的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)预处理溶液，其包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂；(b)染色溶液，其包含染料；以及(c)脱色溶液，其包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂；其中在使膜与所述受试组织接触之后，使(a)所述预处理溶液、(b)所述染色溶液以及(c)所述脱色溶液按此顺序与所述膜的接触表面接触。

技术领域

本申请要求基于于2018年7月31日提交的日本专利申请No.2018-144610、于2018年8月23日提交的日本专利申请No.2018-155979以及于2018年11月28日提交的日本专利申请No.2018-222063的优先权，所有这些的全部公开内容通过引用并入本文。本发明涉及用于在原组织(生組織)中检测生物膜的存在的方法以及用于该方法的试剂盒。

背景技术

慢性伤口，例如压力性溃疡(压力性损伤)和糖尿病足溃疡，具有发生感染的极高风险，因为它们经常暴露于外部细菌，并且宿主的免疫力减弱。近年来，变得清楚的是，细菌生物膜参与慢性伤口的病理生理学。已经强调了基于生物膜的伤口管理(biofilm-basedwound management)，其根据生物膜的存在来管理伤口。

生物膜是通过微生物的固定而形成的群落，并且其主要成分是糖蛋白、蛋白质、胞外DNA等。生物膜作为细菌的贮库存在，并通过形成群体来表现致病性。此外，生物膜可逃脱抗菌剂和宿主免疫力的作用，引起慢性炎症并成为非常强大的感染源(参见NPL 1)。因此，只要在伤口底部存在生物膜，就无法期望愈合。出于该原因，自21世纪前十年的后半期起，一直提倡，作为基于生物膜的伤口治疗(biofilm-based wound therapy)，应根据生物膜的存在来选择伤口处理。具体地，由欧洲、美国和泛太平洋压力性溃疡咨询委员会(EPUAP-NPUAP-PPPIA)在2014年共同发布的国际指南包括“Assessment and treatment ofinfection and biofilms”部分，其中说明了管理方法。该指南建议当例如伤口已经存在超过4周，在过去的2周没有愈合的迹象，存在炎症观察结果，或者存在抗微生物抗性时，怀疑存在生物膜。然而，由于明确诊断生物膜的存在需要组织活检和显微观察，因此在临床实践中实施很难(参见以上NPL 1)。

因此，最近提出了用于通过应用伤口印迹来检测作为生物膜成分的多糖组分而快速使伤口表面上的生物膜分布可视化的技术，所述伤口印迹是用于检测存在于伤口表面上的痕量组分的方法(例如PTL 1、PTL 2和NPL 2至NPL 4)。

PTL 1公开了用于通过使用包含用于检测存在于生物膜的胞外基质中的痕量组分(阴离子细菌外泌多糖，例如聚-β-(1-6)-N-乙酰基-D-葡糖胺和海藻酸)的配体的膜进行的伤口印迹来使伤口表面上生物膜的分布可视化的方法。然而，该方法需要约30分钟以进行检测，并且不适合于在临床实践中，特别是在床边使用。为了改善这一点，PTL 2公开了用于通过不使用生物膜特异性检测配体进行的伤口印迹来直接检测生物膜的方法。具体地，该方法包括使带正电荷的膜(例如，阳离子尼龙膜)与伤口表面接触，用阳离子染料(例如，钌红或阿尔新蓝)对从伤口表面去除的膜进行染色，以及用包含乙酸和1％至2％低醇的水溶液清洗经染色膜，从而可使来源于生物膜的带负电荷的痕量组分以附着于膜的状态被染色。尽管与PTL 1的方法相比，该方法可缩短检测时间，但是其尚不够充分。此外，由于使用了具有刺激性气味的乙酸作为膜清洗溶液的组分，因此该方法不适合在床边实施。

NPL 2至NPL 4公开了用于通过以下使生物膜可视化的方法：清洗伤口表面，然后使硝酸纤维素膜附着于伤口表面持续10秒，并随后将该膜浸渍于对来源于生物膜的多糖组分具有特异性的染色液(钌红或阿尔新蓝)中。根据这些方法，检测所需的时间为约2分钟，并且可容易地在短时间内且在床边非侵入性地检测生物膜。因此，可获得清洗伤口的指标，并且可对伤口进行更合适的局部管理。

引文列表

专利文献