[发明专利]进行实时PCR的方法

说明书

在进行核酸扩增过程（10）的方法中，在分开的反应批次中扩增样品核酸和参比核酸。在此，实时观察扩增信号。根据扩增信号来动态调节扩增循环的数量和/或扩增过程的持续时间。

本发明涉及进行实时PCR的方法，其中，进行PCR循环以扩增样品核酸和参比核酸。此外，本发明涉及被设置用于进行所述方法的计算机程序。

现有技术

聚合酶链反应（PCR）是一种生物分析的灵敏方法，其用于检测特定的基因片段或一般而言的核酸序列。在此，特定DNA序列通过循环复制被复制或扩增。复制所需的酶是DNA聚合酶。在此，复制循环的产物用作下一个复制循环的起始材料或模板（模板）。PCR的一个已知的实施方案是所谓的实时PCR，在其中可以尤其借助荧光探针来追踪反应进程。实时PCR允许DNA初始量的定量，该DNA在扩增前已存在于反应混合物中。所述定量是基于参比测量来实现的，其中在各个反应中并行地在单独的反应批次中随同执行并测量所述参比测量。

聚合酶链反应在多个扩增循环中进行。首先，将起始DNA变性并与此分成其单链（解链）。在这种状态下，引物可以在下一步骤中附着在单链上（退火）。在接下来的步骤中，DNA聚合酶朝着从附着引物开始的方向附着并合成DNA的各自相反链（延伸）。在所述第一个扩增循环后，引物再次变性并附着，然后进一步合成相反链。因此，在反应批次中必须存在作为模板的DNA分子、引物、核苷酸和酶，即DNA聚合酶。变性、引物杂交和延伸的控制是通过调节温度来实现的。因此，PCR过程通常在热循环仪中进行，其中，通常设置约20至50个扩增循环，并且预先调节各自的扩增循环数量。

德国公开文献DE 10 2010 052 524 A1描述了例如一种PCR方法，该方法用于实时地定性和定量检测核酸序列，其中，使用由荧光团标记的DNA探针。在杂交条件下，借助引物产生双链体的混合物，在该双链体上附着有标记的引物。通过添加具有核酸外切酶活性的聚合酶，切断标记的DNA探针并取消猝灭，从而产生可测量的荧光信号。

发明公开内容

本发明提供了进行核酸扩增过程的方法，其中优选在分开的反应批次中扩增样品核酸和参比核酸。根据本发明，实时观察扩增信号，并且根据扩增信号来动态调节扩增循环的数量和/或扩增过程的持续时间。为了观察扩增信号，可以以本身已知的方式检测信号，其中，优选使用荧光探针，以使得可检测已实现的核酸扩增。在此，该系统可以这样地设置，以使得荧光与扩增产物的量成比例地增加，其中，可以使用各种荧光染料。例如，可以使用嵌入在双链DNA中的DNA染料，例如花青染料（例如SYBR® Green 或 PicoGreen®）等。另一种可能性是所谓的FRET探针（福斯特共振能量转移），其中，供体荧光染料与受体荧光染料相互作用。将所检测和评估的扩增信号与对照物建立关系，并在此基础上根据扩增信号来动态调节扩增循环的数量和/或扩增过程的持续时间。因此，本发明的核心是，在该过程的进程期间实时地或在多个时间点上检测和评估来自样品和参比物或对照物的扩增信号，并在此基础上执行预定的行动，这尤其通过动态调节扩增循环的数量和/或扩增过程的持续时间来实现。

所述过程优选是实时PCR，其中，进行PCR循环以扩增样品核酸和参比核酸。在该优选实施方案中，其数量被动态调节的循环是PCR循环。优选地，将扩增信号与各自进行的PCR循环建立关系。例如，可以在各个PCR循环后进行信号的检测和评估。因此，可以基于所述在一定程度上与PCR同步的评估例如在各个循环之后决定，是否应开始新的循环或停止整个PCR过程。例如，如果在包含样品核酸的样品中和/或在包含参比核酸的批次中发现信号增加，则可以停止PCR。因此，可以缩短PCR过程的时间，这通过可以在检测到代表扩增信号的指数增加开始的循环阈值（C_T值）之后结束该过程来实现。另外，由此可以在已经产生特定已知量的PCR产物的时间点停止PCR。因此可以实现的是，尽管PCR条件波动（例如由于含DNA的样品的性质不同），在扩增时总是产生相同的产物量。