[发明专利]基于CRISPR效应系统的扩增方法、系统和诊断

说明书

本文提供了用于扩增和/或检测靶双链或单链核酸的方法和系统。所述方法包括将包含所述靶核酸的样品与扩增反应混合物组合，扩增所述靶核酸，以及通过在等温条件下重复打开、解旋、退火和延伸来进一步扩增所述靶核酸。所述扩增反应混合物可包括扩增CRISPR系统、解旋酶、引物对和聚合酶。所述扩增CRISPR系统可包含第一CRISPR/Cas复合物和第二CRISPR/Cas复合物，所述第一CRISPR/Cas复合物和所述第二CRISPR/Cas复合物可包含第一CRISPR/Cas酶和将所述第一CRISPR/Cas复合物导向所述靶核酸的第一链的第一指导分子；所述第二CRISPR/Cas复合物可包含第二CRISPR/Cas酶和将所述第二CRISPR/Cas复合物导向所述靶核酸的第二链的第二指导分子。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月26日提交的美国临时申请号62/690,257、2018年11月14日提交的美国临时申请号62/767,052和2019年3月14日提交的美国临时申请号62/818,650的权益。以上确认的申请的全部内容特此以引用方式完全并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号MH100706、MH110049和HL141201在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

电子序列表引用

电子序列表(BROD_2595WP_ST25.txt”；大小为11,011字节，创建日期为2019年4月15日)的内容以引用方式整体并入本文。

技术领域

本文所公开的主题总体上涉及与CRISPR效应系统的使用有关的核酸扩增方法、系统和快速诊断。

背景技术

核酸是生物信息的通用标志。在便携式平台上以高灵敏度和单碱基特异性快速检测核酸的能力具有彻底改革许多疾病的诊断和监测的潜力，提供有价值的流行病学信息，并作为普遍的科学工具。尽管已经开发了许多用于检测核酸的方法(Du等人，2017；Green等人，2014；Kumar等人，2014；Pardee等人，2014；Pardee等人，2016；Urdea等人，2006)，但它们不可避免地受损于在灵敏度、特异性、简单性和速度之间进行权衡。举例来说，qPCR方法灵敏但昂贵，并且依赖于复杂仪器，限制了对于在实验室环境中训练有素的操作员的可用性。随着核酸诊断变得与各种医疗保健应用越来越相关，在低成本下提供高特异性和灵敏度的检测技术在临床和基础研究环境两者中将具有很大的实用性。

许多核酸扩增方法可用于各种检测平台。其中已经开发出等温核酸扩增方法，无需剧烈温度循环和复杂仪器即可进行扩增。这些方法包括基于核酸序列的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)或切口酶扩增反应(NEAR)。然而，这些等温扩增方法可能仍需要初始变性步骤和多组引物。此外，将等温核酸扩增与便携式平台相结合的新方法(Du等人，2017；Pardee等人，2016)，在护理点(POC)环境中提供了高检测特异性，但由于灵敏度低而应用有些局限。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种扩增和/或检测靶双链核酸的系统。所述方法包括(a)将包含所述靶双链核酸的样品与扩增反应混合物组合，(b)扩增所述靶核酸，以及(c)通过在等温条件下重复打开、解旋、退火和延伸来进一步扩增所述靶核酸。所述方法任选地包括检测靶核酸的步骤。