[发明专利]用于从头蛋白质测序的方法

说明书

本公开提供了一种确定多肽的氨基酸序列的方法，所述方法包括：使含有所述多肽的第一样品和第二样品分别与第一蛋白酶(例如，胰蛋白酶)和第二蛋白酶(例如，Tryp‑N)接触以产生第一组消化的肽片段和第二组消化的肽片段；对所述组消化的肽片段进行片段化以产生多组片段化的肽离子；从所述组肽离子中选择质量相差精氨酸氨基酸残基或赖氨酸氨基酸残基质量的肽离子对；为从所述两组片段化的肽离子选择的所述肽离子对分配离子类型(N末端肽离子或C末端肽离子)；在任一组片段化的肽离子中选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的相同类型肽离子的质量梯，以及根据所述质量梯装配所述鉴定出的氨基酸残基以确定所述感兴趣的多肽的氨基酸序列。

对序列表的引用

本申请通过引用并入了以计算机可读形式提交的序列表，该计算机可读形式为文件10478WO01-Sequence.txt，该文件于2019年8月16日创建并且包含7,747字节。

技术领域

本发明涉及生物药物，并且涉及蛋白质或多肽序列的从头测定。

背景技术

传统上，蛋白质测序依赖于使用Edman降解化学方法对单个切割的N末端氨基酸进行序列检测，以及例如使用诸如差示HPLC保留和紫外吸收的技术对不同氨基酸Edman衍生物的检测和鉴定。最近，质谱法已被用于以增加的速度、准确性和灵敏度来对蛋白质或多肽进行测序和/或鉴定。然而，这些方法通常为低吞吐量的，并且仍然依赖于Edman降解。尽管在能够同时对大量不同的核酸分子进行测序的高通量大规模并行DNA测序平台方面已经取得了巨大的改进，但是质谱仪性能的进步却是递增的。在用于单独单个氨基酸残基水平的全局蛋白质测序的“下一代”平台的开发方面取得了相对较小的进展。

因此，仍然需要用于对单个多肽进行测序的新颖方法和测定。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了一种用于感兴趣的多肽的氨基酸序列的从头测定的方法，其中该方法包括：在允许切割碱性氨基酸后的肽键的第一蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第一组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第一样品与所述第一蛋白酶接触；对所述第一组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第一组消化的肽片段中的肽相对应的第一组片段化的肽离子；确定所述第一组片段化的肽离子的质量；在允许切割碱性氨基酸之前的肽键的第二蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第二组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第二样品与所述第二蛋白酶接触；对所述第二组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第二组消化的肽片段中的肽相对应的第二组片段化的肽离子；确定所述第二组片段化的肽离子的质量；从所述第一组片段化的肽离子和所述第二组片段化的肽离子中选择质量相差精氨酸氨基酸残基的质量或赖氨酸氨基酸残基的质量的肽离子对；为从所述两组片段化的肽离子中选择的所述肽离子对分配离子类型(N末端肽离子或C末端肽离子)；在任一组片段化的肽离子中选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的相同类型肽离子的质量梯，并从所述肽离子质量梯装配鉴定出的氨基酸残基以确定所述感兴趣的多肽的氨基酸序列。

在该方法的一些实施方案中，第一蛋白酶是胰蛋白酶。

在该方法的一些实施方案中，第二蛋白酶是Tryp-N。

在一些实施方案中，该方法还包括从第一组消化的肽片段中选择第一消化的肽片段；以及从第二组消化的肽片段中选择第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段具有与所述第一消化的肽片段相同的质量。

在一些实施方案中，该方法还包括从第一组消化的肽片段中选择第一消化的肽片段；以及从第二组消化的肽片段中选择第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段的质量具有的与所述第一消化的肽片段的质量差等于赖氨酸氨基酸残基与精氨酸氨基酸残基之间的质量差。