[发明专利]增强基因组工程化效率的方法

权利要求书

1.一种用于在植物细胞中遗传修饰的方法，所述方法包含

(a)将以下共同导入所述植物细胞

(i)基因组工程化组分，和

(ii)第二化合物，其包含

(ii.1)表观遗传调控化学物质或其活性衍生物，特别是DNA甲基转移酶抑制剂或蛋白质脱乙酰基酶抑制剂，优选地是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，和/或

(ii.2)植物激素或其活性衍生物，其优选地选自生长素、细胞分裂素及其组合，和/或

(ii.3)引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒，和

(b)在允许在存在所述第二化合物时通过基因组工程化组分的活性来遗传修饰所述植物细胞的基因组的条件下培养所述植物细胞，

优选地，其中所述基因组工程化组分(i)和/或所述第二化合物(ii)在所述植物细胞中是瞬时有活性的和/或是瞬时存在的。

2.权利要1的方法，其中所述基因组工程化组分包含

a)双链DNA断裂(DSB)诱导酶或编码其的核酸，其优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，以及任选地包含修复核酸分子，或

b)单链DNA或RNA断裂(SSB)诱导酶或编码其的核酸，其优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，以及任选地包含修复核酸分子，或

c)碱基编辑器酶，其任选地与解除武装的DSB诱导酶或SSB诱导酶融合，所述解除武装的DSB诱导酶或SSB诱导酶优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，或

d)影响DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化，组蛋白磷酸化、组氨酸SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化的酶，其任选地与解除武装的DSB诱导酶或SSB诱导酶融合，所述解除武装的DSB诱导酶或SSB诱导酶优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点。

3.权利要求1或2的方法，其中所述基因组工程化组分包含选自以下的DSB诱导酶或SSB诱导酶或其变体：CRISPR/Cas内切核酸酶，优选地CRISPR/Cas9内切核酸酶或CRISPR/Cpf1内切核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)，归巢内切核酸酶，大范围核酸酶和TAL效应物核酸酶。

4.前述权利要求中的任一项的方法，其中步骤(b)中的所述基因组工程化组分的瞬时活性包含在所述植物细胞的基因组中诱导一个或多个双链断裂，在所述植物细胞的基因组中诱导一个或多个单链断裂，在所述植物细胞的基因组中诱导一个或多个碱基编辑事件，或在所述植物细胞的基因组中诱导一个或多个DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化，组蛋白磷酸化、组氨酸SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化。

5.权利要求4的方法，其中在诱导一个或多个双链断裂或一个或多个单链断裂之后为非同源末端连接(NHEJ)和/或通过同源重组机制(HDR)对断裂的同源性定向修复。

6.前述权利要求中的任一项的方法，其中在步骤(b)中所述基因组的修饰选自

a)取代至少一个核苷酸；

b)缺失至少一个核苷酸；

c)插入至少一个核苷酸；

d)DNA甲基化的改变，

e)组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化，组蛋白磷酸化、组氨酸SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化的改变，或

f)a)-e)的任何组合。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善的蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：

a)如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任何一个所示的序列，

b)具有与(a)的序列至少60％相同性的序列，

c)由如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32中任何一个所示的核酸序列编码的序列，和

d)由具有与(c)的核酸序列至少60％相同性的核酸序列编码的序列。