[发明专利]基于CRISPR双切口酶的扩增组合物、系统和方法

说明书

本文所公开的实施方案利用靶向RNA的效应子以提供稳健的基于CRISPR的核酸扩增方法和系统。本文所公开的实施方案可扩增双链核酸靶标和单链核酸靶标两者。此外，本文所公开的实施方案可与各种检测平台例如CRISPR‑SHERLOCK结合，以实现具有渺摩尔级灵敏度的检测和诊断。此类实施方案可用于人类健康的多种情形，包括例如病毒检测、细菌菌株分型、灵敏基因分型，和疾病相关无细胞DNA的检测。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月14日提交的美国临时申请号62/767,059和2018年6月26日提交的美国临时申请62/690,278的权益。以上确认的申请的全部内容特此以引用方式完全并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号MH100706、MH110049和HL141201在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本文所公开的主题总体上涉及与CRISPR效应系统的使用有关的核酸扩增方法、系统和快速诊断。

背景技术

核酸是生物信息的通用标志。在便携式平台上以高灵敏度和单碱基特异性快速检测核酸的能力具有彻底改革许多疾病的诊断和监测的潜力，提供有价值的流行病学信息，并作为普遍的科学工具。尽管已经开发了许多用于检测核酸的方法(Du等人，2017；Green等人，2014；Kumar等人，2014；Pardee等人，2014；Pardee等人，2016；Urdea等人，2006)，但它们不可避免地受损于在灵敏度、特异性、简单性和速度之间进行权衡。举例来说，qPCR方法灵敏但昂贵，并且依赖于复杂仪器，限制了对于在实验室环境中训练有素的操作员的可用性。随着核酸诊断变得与各种医疗保健应用越来越相关，在低成本下提供高特异性和灵敏度的检测技术在临床和基础研究环境两者中将具有很大的实用性。

许多核酸扩增方法可用于各种检测平台。其中已经开发出等温核酸扩增方法，无需剧烈温度循环和复杂仪器即可进行扩增。这些方法包括基于核酸序列的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)或切口酶扩增反应(NEAR)。然而，这些等温扩增方法可能仍需要初始变性步骤和多组引物。此外，将等温核酸扩增与便携式平台相结合的新方法(Du等人，2017；Pardee等人，2016)，在护理点(POC)环境中提供了高检测特异性，但由于灵敏度低而应用有些局限。

发明内容

本公开总体上涉及基于切口酶的核酸扩增和检测方法。

在某些示例性实施方案中，本发明提供了一种扩增和/或检测靶双链核酸的方法，所述方法包括：(a)将包含靶双链核酸的样品与扩增反应混合物组合，所述扩增反应混合物包含：(i)扩增CRISPR系统，所述扩增CRISPR系统包含第一CRISPR/Cas复合物和第二CRISPR/Cas复合物，所述第一CRISPR/Cas复合物包含第一基于Cas的切口酶和将所述第一CRISPR/Cas复合物导向靶核酸上的第一位置的第一指导分子，并且所述第二CRISPR/Cas复合物包含第二基于Cas的切口酶和将所述第二CRISPR/Cas复合物导向靶核酸的第二位置的第二指导分子；和(ii)聚合酶；(b)扩增靶核酸；(c)向反应混合物添加包含第一引物和第二引物的引物对，所述第一引物包含与靶核酸的第一位置互补的部分和包含第一指导分子的结合位点的部分，并且所述第二引物包含与靶核酸的第二位置互补的部分和包含第二指导分子的结合位点的部分；以及(d)通过在等温条件下重复延伸和切刻来进一步扩增靶核酸。