[发明专利]吡咯赖氨酰-tRNA合成酶

权利要求书

1.一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和非天然氨基酸接触的工序,且包括选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序,

工序(a)：与利用使用了马氏甲烷八叠球菌的PylRS(MmPylRS)的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸；

工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况、以及利用使用了具有受glnS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。

2.根据权利要求1所述的制作方法,其中,

所述引入工序是与使用MmPylRS作为PylRS的情况相比以1.5倍以上的效率向多肽引入非天然氨基酸的工序。

3.根据权利要求1或2所述的制作方法,其中,

所述接触是在含有高浓度的所述PylRS的非天然氨基酸引入系统中进行的。

4.根据权利要求3所述的制作方法,其中,

所述非天然氨基酸引入系统为无细胞蛋白质合成系统的反应溶液,所述引入工序为所述工序(a)。

5.根据权利要求4所述的制作方法,其中,

所述反应溶液含有15μM以上的PylRS。

6.根据权利要求4或5所述的制作方法,其中,

所述反应溶液含有多核苷酸,所述多核苷酸编码与天然型在不同位点具有终止密码子的基因。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制作方法,其包括混合含有5mg/mL以上的所述PylRS的溶液和非天然氨基酸从而制备混合溶液的工序，所述引入工序为所述工序(a)。

8.根据权利要求3所述的制作方法,其中,

所述非天然氨基酸引入系统为活细胞蛋白质合成系统的细胞,所述引入工序为所述工序(b)。

9.根据权利要求8所述的制作方法,其中,

所述细胞含有编码MaPylRS和高表达启动子的多核苷酸。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanomethylophilus属、Methanomassiliicoccus属或Methanoplasma属生物、或者Methanomassiliicoccales archaeon RumEn M1、Methanogenic archaeonISO4-H5、Methanogenic archaeon ISO4-G1或Thermoplasmatales archaeon BRNA1的PylRS。

11.根据权利要求1～9中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanomethylophilus属生物的PylRS。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS与马氏甲烷八叠球菌的PylRS进行序列比对时,所述PylRS具有N末端侧的至少50个氨基酸缺失的氨基酸序列。

13.根据权利要求1～11中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanomethylophilus alvus的PylRS(MaPylRS)。

14.根据权利要求1～10中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanogenic archaeon ISO4-G1的PylRS(G1PylRS)。