[发明专利]细胞选择方法

权利要求书

1.一种筛选转基因细胞群体中产生目的蛋白的细胞的方法，所述方法包括：

a)在允许蛋白合成的培养条件下培养所述转基因细胞，其中所述细胞培养条件包含在细胞培养基中的至少一种非天然氨基酸(nnAA)，并且

b)确定所述转基因细胞中的哪些细胞产生所述目的蛋白，

其中所述转基因细胞包含(i)编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含至少一种nnAA、第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码的结构域有助于当所述转基因细胞表达所述第二结构域时检测产生所述目的蛋白的所述转基因细胞，和(ii)至少一种正交tRNA和接受至少一种nnAA并识别所述至少一种正交tRNA的至少一种正交tRNA合成酶。

2.如权利要求1所述的方法，其中编码所述至少一种nnAA的多核苷酸是琥珀终止密码子，所述琥珀终止密码子在所述nnAA存在下支持翻译终止的抑制。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种nnAA是吡咯赖氨酸，所述正交tRNA是吡咯赖氨酰-tRNA(tRNA-Pyl)，并且所述正交tRNA合成酶是吡咯基-tRNA合成酶(PyrlRS)。

4.如权利要求1-3所述的方法，其中所述融合蛋白的所述第二结构域包含跨膜蛋白结构域、细胞膜锚结构域或标签。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述转基因细胞是哺乳动物细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述转基因细胞是CHO细胞、HEK293细胞、PERC6细胞、COS-1细胞、HeLa细胞、VERO细胞或小鼠杂交瘤细胞。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述转基因细胞是原核细胞。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白在所述第一和第二结构域之间包含接头肽序列。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二结构域是跨膜蛋白结构域。

10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二结构域是细胞膜锚结构域，所述细胞膜锚结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号肽，所述信号肽促进所述目的蛋白锚定到细胞膜中存在的GPI部分。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述GPI信号肽是来自衰变加速因子7蛋白(DAF-7)的GPI信号肽。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白的所述第一结构域是抗体或抗体片段。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中确定所述目的蛋白是否在所述转基因细胞中或上产生包括确定在所述转基因细胞表面上展示的目的蛋白的水平，以确定所述转基因细胞中的哪些细胞与所述转基因细胞群体中的其他转基因细胞相比产生更高水平的所述目的蛋白。

14.如权利要求13所述的方法，其中将产生更高量的所述目的蛋白的转基因细胞与产生更低量的所述目的蛋白的转基因细胞分离。

15.如权利要求14中任一项所述的方法，其中分离所述转基因细胞包括使用荧光激活细胞分选(FACS)。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中分离的更高产转基因细胞随后在允许蛋白合成的细胞培养条件下培养。