[发明专利]基于T细胞的免疫疗法的基因靶标

说明书

本文提供了相较于野生型T细胞经刺激时展现出增殖增加的遗传修饰的T细胞，生成这类T细胞的方法，和使用该T细胞治疗疾病诸如癌症的方法。

相关申请的交叉引用

该申请要求2018年7月9日提交的美国临时专利申请号62/695,672的优先权权益，其通过引用纳入本文。

背景技术

细胞毒性T细胞在免疫介导的肿瘤控制和自身免疫中起着重要作用。免疫疗法，诸如检查点阻断或基于工程改造的细胞的疗法，正在彻底改变癌症治疗，在患有其他难治性恶性疾病的部分患者中实现持久的反应。然而，尽管在一些患者中取得了显著的效果，但是大多数患者对可用的免疫疗法没有反应。

下一代过继细胞疗法正在利用CRISPR-Cas9基因组工程改造进行开发。可以将Cas9核糖核蛋白递送至原代人T细胞以高效地敲除检查点基因(Ren等,2017；Rupp等,2017；Schumann等,2015)或甚至重写内源性基因组序列(Roth等)。虽然缺失编码PD-1的典型检查点基因可以增强对某一些癌症的反应(Ren等,2017；Rupp等,2017)，但是一组扩大的靶标将提供额外的治疗机会。免疫疗法中的进展取决于对于确定T细胞在遇到其靶抗原时如何反应的遗传程序的进一步了解。有希望的基因靶标可以在刺激后增强细胞增殖和有效效应子反应。此外，免疫抑制细胞和可溶性分子诸如细胞因子和代谢物可以在肿瘤内累积并阻碍有效抗肿瘤T细胞反应。影响T细胞克服免疫抑制性肿瘤微环境能力的基因靶标可以将过继性细胞疗法扩展到实体器官癌症。

数十年的动物模型和细胞系研究已经鉴定了T细胞抑制和激活的调节剂，但是仍然缺少系统的策略来全面分析调节人T细胞反应的基因的功能。使用选定的RNA干扰文库进行基因敲减指向增强小鼠模型中体内抗原反应性T细胞增殖的靶标(Zhou等,2014)。最近，CRISPR-Cas9开创了功能性遗传学研究的新纪元(Doench，2018)。容易设计单向导RNA(sgRNA)的大文库，以靶向基因组序列。用编码这些sgRNA的慢病毒转导细胞产生具有不同基因组修饰的细胞池，所述基因修饰可以通过整合的前病毒中的sgRNA序列追踪。该方法已用于经稳定的Cas9表达工程改造的细胞系以及Cas9转基因小鼠模型中(Parnas等,2015；Shang等,2018)。汇集CRISPR筛选已经揭示了人癌细胞中调节T细胞免疫疗法反应的基因靶标(Manguso等,2017；Pan等,2018；Patel等,2017)。

发明内容

本公开(部分)基于一种新方法，即用Cas9蛋白电穿孔的sgRNA慢病毒转染(SLICE)，来鉴定原代人T细胞中刺激反应的调节剂。全基因组功能丧失筛选鉴定了在刺激后对增殖产生负面调节的重要T细胞受体信号组件和基因。靶向消融单个候选基因验证了命中(hit)并鉴定了增强癌细胞杀伤的扰动(perturbation)。与单细胞RNA-seq偶联的SLICE揭示了由关键遗传扰动改变的特征性刺激-反应基因程序。SLICE全基因组筛选也适用于鉴定免疫抑制的介导物，这揭示了控制腺苷信号传导反应的基因。因此，本文提供了经修饰以抑制靶基因表达的造血细胞，诸如干细胞和T细胞。因此，例如，在本公开中所述的遗传修饰可以用于调节CD8+T细胞增殖和功能。