[发明专利]具有可调孔径的生物纳米孔及其作为分析工具的用途

说明书

本发明涉及纳米孔(具体为工程化的Fragaceatoxin C(FraC)纳米孔)及其在分析生物聚合物和其它(生物)化合物(如单分子(蛋白质)测序)中的应用的领域。提供了包含在脂质双层中含有的低聚FraC纳米孔的系统，其中处于七聚体(II型)状态的纳米孔级分和处于六聚体(III型)状态的纳米孔级分的总和占FraC纳米孔总数的至少60％。

本发明通常涉及纳米孔及其在分析生物聚合物和其它(生物)化合物中的用途的领域。具体地，本发明涉及工程化的Fragaceatoxin C(FraC)纳米孔及其在单分子分析(如单分子肽测序)中的应用。

生物纳米孔是打开在生物膜或合成膜上的纳米级水管的蛋白质。在外部电势下，穿过单纳米孔的离子电流被用于识别横穿纳米孔的分析物。最值得注意的是，纳米孔现在被用于单分子水平的核酸测序。在纳米孔DNA测序中，单独核酸序列通过纳米孔被逐个碱基穿线，而离子电流则被用于鉴定单独的核碱基^1,2。

Watanabe等人(Analytical Chemistry 2017 89(21)，11269-11277)描述了孔形成的分析和使用五个不同的成孔蛋白(包括FraC)中的大纳米孔进行的单个蛋白分子的检测。它证明，通过对通道电流信号进行分类并进行噪声分析，可以实现适合纳米孔传感的孔的鉴定。

然而，用纳米孔进行蛋白质测序呈现了一系列新的挑战。与核碱基相比，氨基酸具有更大的化学可变性，并且它们不能被纳米孔内部的电势均匀地捕获或拉伸。此外，还不知道能逐个氨基酸处理蛋白质或多肽的酶。

可替代地，可以先将蛋白质片段化，然后再通过纳米孔电流鉴定单独的肽的质量。该方法将类似于使用串联质谱的常规蛋白质测序方法。然而，纳米孔肽质量鉴定器将具有低成本、便携式和单分子的优点。后者很重要，因为它将允许分析翻译后修饰中的化学异质性，尤其是当与高通量装置连接时，允许检测低丰度的蛋白质。先前对PEG分子^3,4,5,6,7,8、中性肽⁹或寡糖¹⁰、均匀带电的肽^{11,12,13,14,15}和其它肽¹⁶的研究表明，当分析物的组成均一时，当前阻滞的深度与聚合物的分子量之间可能存在直接相关性。另一方面，大量其它研究(包括对DNA^17,18和氨基酸对映体¹⁹的研究)表明，分子的化学特性，尤其是纳米孔²⁰内部的电荷对离子电流有强烈且不可预测的影响，这表明鉴定大量复杂的生物聚合物(如肽)可能是不可能的。另一种复杂性是，不能以固定的电势有效捕获和分析带相反电荷的肽^{16,21,22,23,24}。最后，生物纳米孔的直径和几何形状不容易适于研究溶液中多肽的大小、形状和化学组成的阵列。

最近，我们已经表明，来自海葵Actinia fragacea的八聚体Fragaceatoxin C(FraC)纳米孔²⁵可被用于研究DNA²⁶、蛋白质和肽²⁷。还参见本申请人的WO2018/012963。与生物聚合物分析中使用的其他纳米孔相比，FraC的跨膜区是独特的，因为它是由α-螺旋形成的，这些螺旋描述了纳米孔的反式出口处的尖且窄的缩颈(constriction)。至关重要的是，我们表明，可以将穿过纳米孔的电渗流工程化以在固定电势下捕获多肽，尽管它们具有电荷组成²⁷。然而，大小小于1.6kDa的肽在穿过纳米孔时移动太快而无法采样。

基于这些研究，本发明的发明人意识到并承认，需要较小直径的纳米孔来检测具有较低分子量的肽。因此，他们旨在提供允许调整FraC纳米孔直径的策略，使得可以鉴定更大范围的肽大小。