[发明专利]由多能干细胞制作肠细胞的方法

说明书

作为制作显示与实际的肠细胞接近的功能的多能干细胞来源的肠细胞的方法，提供肠细胞的制作方法，其中，使用以包含GSK3抑制剂、和选自肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇、和二甲基亚砜中的至少1种为特征的肠细胞分化用培养基。

技术领域

本发明涉及肠细胞分化用培养基、由多能干细胞制作肠细胞的方法、和通过该方法制作的肠细胞。

背景技术

肠是对于营养素、水和药物的吸收重要的组织，药物的吸收和代谢决定药物的生物学利用率，因此对于药物开发也是重要的。为了药物开发，人结肠癌细胞株Caco-2作为用于试验吸收和代谢功能的肠上皮的模型被广泛使用。然而，大肠来源的Caco-2细胞代谢酶的活性低、而且其代谢酶的活性与小肠的不类似(Hubatsch et al.(2007).Nat.Protoc.2,2111-2119；Sun et al.(2002).Pharm.Res.19,4-6)。进而，Caco-2细胞在细胞株间存在特性的差异。因此，需要确立与人小肠类似、在药物试验中能够替换Caco-2细胞的人体外(invitro)模型。

人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导多能干细胞(hiPSCs)(Takahashi et al.(2007).Cell 131,861-72)具有分化成所有源自三个胚层的细胞、通过暴露于合适的生长因子而分化成特定细胞的能力。最近的研究显示，胚胎干细胞(ES)、诱导多能干细胞(iPS)分化成胚胎内胚层、由其诱导的器官例如胰脏、肝脏、肠。

在肠道上皮，由肠干细胞(ISC)生成吸收性的细胞、分泌细胞(例如，杯状细胞、肠内分泌细胞、Paneth细胞)这样的分化的细胞(Nakamura et al.(2007).J.Gastroenterol.42,705-10；Sato,T.and Clevers,H.(2013).Science 340,190-194)。通过突变小鼠的研究搞清楚了，Wnt/β-联蛋白和Notch信号转导这样的参与肠干细胞的增殖以及分化的维持和调节的多个基因和因子(Buczacki et al.(2013).Nature 495,65-9；Chiba,(2006).Stem Cells 24,2437-47；Fre et al.(2005).Nature 435,964-8；Fre etal.(2009).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,6309-14；Gerbe et al.(2011).J.CellBiol.192,767-80；Gregorieff et al.,(2015).Nature)。ISC表达LGR5(Barker et al.(2007).Nature 449,1003-7)。LGR5是在结合R-spondin 1时介导Wnt/β-联蛋白信号转导的Wnt信号转导受体。组织培养中通过维持ISC的因子的筛选，将表皮生长因子(EGF)、头蛋白(Noggin)和R-spondin 1定义为在培养中维持ISC的微环境(niche)因子(Sato et al.(2009).Nature 459,262-5)。已知细胞外基质对于ISC的维持是重要的，所以使用基质胶(matrigel)，为了支持ISC的增殖而补充增殖因子。然后，根据分子化合物筛选，通过补充作为微环境(niche)因子的Wnt3a、EGF、头蛋白(Noggin)、R-spondin 1、烟酰胺、A83-01(也称为TGF-βI型受体激酶的抑制剂、激活素样激酶5(ALK5))，从而确立了由成人人小肠原代细胞或结肠上皮组织的长期类器官培养法(Sato et al.(2011)Gastroenterology 141,1762-1772)。

已知利用ISC的类器官培养系统，通过激活素使hiPSC分化成胚胎内胚层后，用补充了高浓度的FGF和Wnt的基质胶(matrigel)培养，从而分化成肠细胞(Spence et al.(2011).Nature 470,105-9)。但是，这些hiPSC来源的细胞由于表达Lgr5的细胞数少，因而被认为是未成熟的细胞。报告了将这些iPSC来源肠细胞长期培养，移植到小鼠肾小囊下，从而进一步成熟，在移植6周后生成了分化的细胞(Watson et al.(2014).Nat.Med.20)。