[发明专利]核酸酶介导的核酸修饰

说明书

本文提供涉及基因和基因组的分子生物学操作的技术，并且特别但非排他性地涉及用于改进的基因编辑的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)方法、组合物、系统和试剂盒。

本申请要求2018年7月16日提交的美国临时专利申请序列号62/698376的优先权，其通过参考以其全部结合至本文中。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明在国立卫生研究院授予的GM122181的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。

领域

本文提供涉及基因和基因组的分子生物学操作的技术，并且特别但非排他性地涉及用于改进的基因编辑的CRISPR (成簇的规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats))方法、组合物、系统和试剂盒。

背景

CRISPR/Cas9 (CRISPR相关蛋白9)被广泛用于基因编辑。然而，用于基因编辑的CRISPR和相关技术在靶位点处“敲入”(KI)大片段序列(例如报告基因)的效率低。特别是，敲入效率通常低于1%。因此，需要改进的技术。

概述

本文提供一种与经修饰的CRISPR/Cas9相关的技术，用于改进的在靶位点处敲入核酸插入片段的整合。在一些实施方案中，该技术使人类细胞(例如原代细胞、多能干细胞和成体干细胞)中一系列基因座处的大尺寸插入片段的KI效率提高到几倍。此外，相对于例如使用常规Cas9蛋白的常规CRISPR方法，本文提供的CRISPR技术显著减少脱靶整合。如本文所述，改进的CRISPR技术可用于与基因编辑研究和治疗相关的广泛应用。

因此，本文提供与包含基因编辑核酸酶结构域和BE27结构域的基因编辑核酸酶-BE27融合蛋白相关的技术。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含CRISPR相关的系统蛋白、其一部分、其同源物或其修饰形式。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含Cas蛋白、其一部分、其同源物或其修饰形式。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、C2c1、C2c2、HiFiCas9、spCas9mSA、HypaCas9 (参见例如Chen (2017) “Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy”Nature 550 (7676):407-410，通过参考结合至本文中)和xCas9 (参见例如Hu (2018)“Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity”Nature 556 (7699):57-63，通过参考结合至本文中)的Cas蛋白、其一部分、其同源物或其修饰形式。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含TALEN、其一部分、其同源物或其修饰形式。在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含ZFN、其一部分、其同源物或其修饰形式。

在一些实施方案中，基因编辑核酸酶结构域包含如通过参考结合至本文中的Slaymaker (2016) “Rationally engineered Cas9 nucleases with improvedspecificity” Science 351 (6268):84-8中描述的eSpCas9。