[发明专利]基于细胞的梭菌神经毒素测定法

说明书

本发明涉及一种鉴定调节梭菌神经毒素活性的基因的方法，所述方法包括：a)提供人神经元细胞的样品，所述人神经元细胞表达包含C端可检测标记物的多肽，其中多肽是借助梭菌神经毒素可切割的；b.改变细胞的靶基因表达；c.使细胞与梭菌神经毒素接触；d.测量C端可检测标记物的量，因而对梭菌神经毒素活性定量；并且e.当定量的梭菌神经毒素活性不同于靶基因的表达未改变时的定量的梭菌神经毒素活性时，鉴定靶基因为梭菌神经毒素活性的调节物；或f.当定量的梭菌神经毒素活性等于靶基因的表达未改变时的定量的梭菌神经毒素活性时，鉴定靶基因不是梭菌神经毒素活性的调节物。还提供了鉴定调节梭菌神经毒素活性的试剂的相关方法，以及适用于本发明方法中的人神经元细胞、核苷酸、载体、多肽、试剂盒和组合物。

本发明涉及基于细胞的梭菌神经毒素测定法。

梭菌属(Clostridia)细菌产生高度强效和特异性的蛋白质毒素，其可以毒害所送抵的神经元和其他细胞。这类梭菌神经毒素的示例包括破伤风菌(C.tetani)产生的神经毒素(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)血清型A-G、和X产生的神经毒素(BoNT)(参见WO 2018/009903 A2)、以及巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的那些神经毒素。

在梭菌神经毒素当中有一些已知最强效的毒素。例如，取决于血清型，肉毒神经毒素对小鼠具有0.5至5ng/kg的中位致死剂量(LD₅₀)值。破伤风毒素和肉毒毒素均通过抑制受累神经元的功能、尤其抑制神经递质释放发挥作用。尽管肉毒毒素在神经肌肉接头发挥作用并且抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素在中枢神经系统里发挥作用。

在自然界中，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，所述单链多肽通过蛋白酶剪切事件受到翻译后修饰，以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。切割过程在位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的特异性切割位点(经常称作活化位点)发生。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链称作重链(H-链)(具有大约100kDa分子质量)和轻链(L-链)(具有大约50kDa分子质量)。H-链包含N端转位组分(H_N结构域)和C端靶向组分(H_C结构域)。切割位点位于L-链和转位结构域组分之间。在H_C结构域与其靶神经元结合并且和结合的毒素借助内体内化入细胞后，H_N结构域转运L-链跨过内体膜并进入胞液，并且L-链提供蛋白酶功能(也称作非细胞毒蛋白酶)。

非细胞毒蛋白酶通过蛋白酶解式切割称作SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白发挥作用–参见Gerald K(2002)“Cell and MolecularBiology”(第4版)John WileySons,Inc。首字母缩略词SNARE衍生自自术语可溶性NSF接合受体，其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺敏感因子。其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺敏感因子。SNARE蛋白对胞内小泡融合不可或缺，并且因此对分子经由小泡运输从细胞分泌不可或缺。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对SNARE蛋白显示出高度的底物专一性。因此，一旦输送至预期的靶细胞，非细胞毒蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒蛋白酶。

小鼠LD₅₀测定法目前是FDA批准用于肉毒毒素释放的唯一测定法。该测定法同时地测试肉毒神经毒素的全部三个结构域的作用(即结合、转位和蛋白酶)。更详细地，它规定了在规定时间点、通常给药后2-4天的毒素中位致死性腹膜内剂量(活性以小鼠LD₅₀单位表述)。然而，遗憾地，LD₅₀测定法使用大量的动物。另外，LD₅₀单位不是绝对量值，因为它们不是生物学常数-它们本身高度依赖于分析条件。具体地说，与这种测定法相关的误差可以在不同检验机构之间高达60％(Sesardic等人2003；Biologicals 31(4):265-276)。